脱氧胆酸在人结肠癌细胞株HCT116迁移和侵袭中的作用及其机制研究

赵会君 孔 炫 房静远

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所(200001)

结直肠癌是消化系统常见恶性肿瘤，病死率在恶性肿瘤中居第四位［1］。动物脂肪摄入量增加是促进结直肠癌形成的重要因素［2］。动物脂肪摄入量增加可促进胆汁酸分泌，导致体内次级胆汁酸含量增加。脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)是参与肠肝循环的一种次级胆汁酸，研究［3］显示结直肠癌患者粪便中的DCA含量明显高于健康人，且DCA含量升高的结直肠癌患者肿瘤复发风险显著增加。Yui等［4］的研究显示，DCA可诱导结肠上皮细胞DNA损伤、线粒体破坏，促进结肠上皮细胞凋亡，并可引起细胞基因组不稳定性，导致基因突变增加，进而促进结肠癌发生。Da Silva等［5］的研究发现，DCA在体外可通过激活蛋白激酶B和p38，促进ERK1/2磷酸化，诱导结肠癌细胞增殖。DCA是生理状态下体内长期存在的代谢分子，然而目前研究多为以高浓度DCA短时间刺激细胞，采用长时间慢性刺激的研究甚少。本研究以DCA长时间刺激人结肠癌细胞株HCT116，探讨DCA在结肠癌细胞迁移和侵袭中的作用及其机制，以期为结直肠癌的防治提供理论依据。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人结肠癌细胞株HCT116购自American Type Culture Collection(ATCC)，培养于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中(37℃，5%CO2)。DCA、DMSO购自Sigma公司，CCK-8试剂盒购自东仁化学科技(上海)有限公司，Matrigel基质胶购自BD公司，Transwell小室购自Millipore公司，Bradford蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所，兔抗人上皮型钙黏蛋白(E-cadherin，E-cad)抗体、鼠抗人神经型钙黏蛋白(N-cadherin，N-cad)抗体、兔抗人维生素D受体(VDR)抗体购自Abcam公司，GAPDH抗体、HRP标记的羊抗兔二抗、兔抗鼠二抗购自上海康成生物工程有限公司，ECL试剂盒购自Pierce公司。

二、方法

1.细胞增殖率检测:取对数生长期HCT116细胞，以5×103/孔接种于96孔板，培养24 h，更换为无血清McCoy’s 5A培养基培养6 h，分别以含DCA 12.5、50、200 μmol/L 和 DMSO 的培养基处理细胞0、12、24、36 h，吸除培养基，加入 100 μL 无血清培养基和10 μL CCK-8试剂，37℃培养2 h，于酶标仪450 nm波长处测定吸光度(A)值。细胞增殖率(%)=(实验孔A值-空白孔A值)/(阴性对照孔A值-空白孔A值)×100%，根据细胞增殖率绘制生长曲线。

2.细胞迁移能力检测:取对数生长期HCT116细胞，接种于25 cm2培养瓶，以含 DCA 12.5 μmol/L的McCoy’s 5A培养基培养，隔天换液，以含DMSO的培养基作为阴性对照组。培养3 d后消化细胞，接种于6孔板培养24 h，待细胞密度达到100%，以无菌黄色Tip头于6孔板内划痕，PBS冲洗，加入含DCA 12.5 μmol/L或DMSO的培养基培养，显微镜下多位点拍照，4 d后再次拍照观察划痕愈合情况。

3.细胞侵袭能力检测:细胞培养同迁移能力检测。培养5 d后消化细胞，以含DCA 12.5 μmol/L或DMSO的无血清培养基重悬细胞至1.0×106/mL。以经无血清培养基稀释的 Matrigel基质胶(1∶3)包被Transwell小室底部膜的上室面，待基质胶稀释液聚合成凝胶，取细胞悬液200 μL加入小室，下室加入含30%胎牛血清和DCA 12.5 μmol/L或DMSO的培养基，培养2 d后取出小室，以棉签擦除小室聚碳酸酯膜上表面细胞和凝固的基质胶，4%多聚甲醛固定 15 min，0.1%结晶紫溶液染色30 min，倒置显微镜下观察并任意选取5个视野(×20)计数聚碳酸酯膜下表面细胞，结果取均值。

4.蛋白质印迹法检测E-cad、N-cad、VDR蛋白表达:取对数生长期HCT116细胞，分别以含DCA 12.5 μmol/L的培养基处理 1、3、7、14、28 d，或以含DMSO的培养基处理28 d，收集细胞提取总蛋白，以Bradford法行蛋白定量。每一样本取100 μg蛋白上样，行10%变性SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭，分别加入兔抗人E-cad抗体(1∶200)、鼠抗人N-cad抗体(1∶500)、兔抗人VDR抗体(1∶500)和GAPDH抗体(1∶5000)，4℃过夜，TBST洗膜，加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶5000)或兔抗鼠二抗(1∶5000)，室温孵育1 h，ECL显影，凝胶成像系统拍照和分析。

三、统计学分析

结 果

一、HCT116细胞增殖率

CCK-8 实验结果显示，经 12.5、50、200 μmol/L DCA作用36 h的 HCT116细胞，细胞增殖率较DMSO组明显升高，以12.5 μmol/L组升高最为显著(P＜0.05)(见图1)。

二、HCT116细胞迁移力和侵袭力

划痕实验结果显示，经12.5 μmol/L DCA作用7 d的HCT116细胞，细胞迁移力较DMSO组明显增强(见图2);Transwell实验结果显示，该组细胞侵袭力亦较DMSO组显著增强(P＜0.01)(见图3)。

图1 不同浓度、不同时间DCA处理组HCT116细胞增殖率比较

图2 12.5 μmol/L DCA处理对 HCT116细胞迁移力的影响(划痕实验)

三、E-cad、N-cad、VDR 蛋白表达

蛋白质印迹法检测结果显示，DCA组E-cad和N-cad表达水平随DCA作用时间的延长而升高，第28 d时明显高于DMSO组;DCA组VDR表达水平在第1 d时较DMSO组有所上升，其后呈下降趋势，第28 d时较DMSO组明显降低(见图4)。

图 4 12.5 μmol/L DCA 处理对 HCT116 细胞 E-cad、N-cad、VDR表达的影响(蛋白质印迹法)

讨 论

DCA是参与肠肝循环的次级胆汁酸，作为一种诱导结直肠癌发生的代谢产物，近年来在人群流行病学和基础研究方面得到广泛关注。近年研究发现DCA可促进结肠癌细胞增殖，然而其在结肠癌细胞迁移和侵袭中的作用尚未明确。本研究以不同浓度DCA刺激人结肠癌细胞株HCT116，证实DCA可促进HCT116细胞增殖，浓度为12.5 μmol/L时效应较 50、200 μmol/L 显著，因此以12.5 μmol/L作为理想剂量进行后续研究。

肿瘤远处转移是结直肠癌患者死亡的主要原因。本研究通过以DCA刺激HCT116细胞较长时间，探讨DCA对HCT116细胞迁移力和侵袭力的影响，结果显示经DCA作用7 d的HCT116细胞，细胞迁移力和侵袭力显著增强。进一步以DCA作用于HCT116 细胞 1、3、7、14、28 d，研究 DCA 对上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相关标记物E-cad、N-cad表达的影响，结果发现两者表达水平随DCA作用时间的延长而升高，第28 d时明显高于DMSO组。E-cad是维系细胞间紧密连接的钙连接蛋白，在EMT过程中表达减少或缺失，而N-cad在EMT过程中表达增加，该变化可促进癌细胞迁移［6］。然而有学者指出，细胞在经历EMT时，并非所有的EMT标记物均会发生变化［7］。Nieman等［8］的研究发现，在E-cad未发生明确变化的情况下，N-cad可促进人乳腺癌细胞迁移和侵袭。Cho等［9］对肝细胞癌的研究显示，N-cad不仅能促进癌细胞侵袭，还可促进癌细胞增殖，并抑制其凋亡。由此可见，本研究中N-cad表达水平升高即可证实DCA对结肠癌细胞的迁移、侵袭具有促进作用，而E-cad表达水平升高在此过程中的作用有待进一步明确。

图3 12.5 μmol/L DCA处理对HCT116细胞侵袭力的影响(Transwell实验，×20)

VDR是肠道上皮细胞的核受体之一，可通过抑制Wnt/β-catenin通路，阻止结直肠癌早期恶性演变，对肿瘤发生、发展具有抑制作用［10］。研究［11-12］显示，约90%的结直肠癌患者存在VDR表达下调，低分化结直肠癌组织的VDR表达水平较高分化结直肠癌组织降低。EMT相关转录因子SNAIL1、SNAIL2可抑制VDR表达，而VDR可促进E-cad表达［13-14］。本研究结果显示，DCA作用于HCT116细胞后，VDR表达水平呈双向变化，在短时间内(第1 d)呈上升趋势，但3、7、14、28 d 后呈下降趋势，推测DCA作用后VDR表达在短时间内升高可能是细胞为适应并抑制DCA的毒性作用而产生的反应性调节，但后期该调节作用减弱，VDR表达呈下降趋势，促进结肠癌细胞迁移、侵袭。

综上所述，DCA可促进结肠癌细胞增殖，且较长时间(7 d)的DCA刺激能显著增强结肠癌细胞的迁移力和侵袭力，其机制可能与上调N-cad表达和下调VDR表达有关，然而具体作用机制仍未完全明确，有待后续进一步深入研究。

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