白桦叶精油的抑菌和抗氧化活性成分分析

段晓玲 王海英 杨国亭 冯晨 崔莹

摘要 [目的]探究白桦（Betula platyphylla）叶精油的抑菌和抗氧化活性成分，为白桦木醋液、精油等高附加值植物天然产品的加工利用提供基础数据。[方法]以白桦叶为原料，采用多相同时蒸馏萃取（SDE）法提取白桦叶精油，研究其抑菌、抗氧化活性，通过气相色谱-质谱（GC-MS）法分析其挥发性化学成分。[结果]白桦叶精油对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）均具有抑制作用，抑菌圈直径分别为11.90±2.17和（9.01±1.31）mm;白桦叶精油对羟自由基具有较好的清除作用，其EC50为2.294 mg/ml;白桦叶精油主要由烷烃类、酯类、酮类、酚类、醇类、醛类等化合物组成，GC含量最高的化合物是十一烷（58.02%）。[结论]白桦叶精油在抑菌和抗氧化等深加工产品领域具有潛在开发价值。

关键词 白桦;精油成分;抑菌活性;抗氧化活性

中图分类号 S713 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11746-03

Composition Analysis of Antibacterial and Antioxidant Activities of Essential Oil in Leaves of Betula platyphylla

DUAN Xiao-ling1， WANG Hai-ying1*， YANG Guo-ting2 et al

（1. College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040; 2. Center for Ecological Research， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] Antibacterial and antioxidant activities composition of essential oil in leaves of Betula platyphylla were studied to provide basic data for processing and utilization of wood vinegar，essential oil and other natural plant products of B. platyphylla with high added value. [Method] Essential oil in leaves of B. platyphylla was extracted by multiphase simultaneous distillation extraction（SDE） method with leaves of B. platyphylla as raw materials. Antibacterial and antioxidant activities of essential oil in leaves of B. platyphylla were studied， and their volatile chemical composition were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS） method. [Result] The research results show that Staphylococcus aureus and Escherichia coli are inhibited by essential oil in leaves of B. platyphylla， diameter of inhibition zone is （11.90±2.17） mm and （9.01±1.31） mm respectively; Essential oil in leaves of B. platyphylla has good scavenging activity on hydroxy radical， its EC50（concentration for 50% of maximal effect， EC50） is 2.294 mg/ml; Essential oil in leaves of B. platyphylla is mainly composed of alkanes， esters， ketones， phenols， alcohols， aldehydes， and other compounds. The highest GC content compound is undecane（58.02%）. [Conclusion] Essential oil in leaves of B. platyphylla has potential value in the antibacterial and antioxidant products deep processing field.

Key words Betula platyphylla; Essential oil composition; Antibacterial activity; Antioxidant activity

基金项目 黑龙江省自然科学基金资助项目（C201411）;黑龙江省科技攻关计划项目（GC07C330）;中央财政林业科技推广示范项目（2009-01）。

作者简介 段晓玲（1990- ），女，云南腾冲人，硕士研究生，研究方向：林下经济植物次生代谢产物调控与应用。*通讯作者，副教授，博士，硕士生导师，从事植物资源化学以及木醋液、精油、纤维素等林下经济资源利用研究。

收稿日期 2014-10-16

通过森林植物资源化学加工利用可获得木醋液、精油等植物天然产品[1-6]。干馏法是获得木醋液的主要提取方法，原料主要是木材加工废弃物（木屑等）、枝桠等采伐剩余物。水蒸气蒸馏法是提取精油的主要方法，原料主要是芳香植物的根、茎、叶、花、果实、种子、木材加工废弃物（木屑等）、枝桠等采伐剩余物;对于一些较难提取的精油，如杉根精油等，可通过干馏法获得木醋液和精油的混合物，经分离后得到杉根精油[5-7]。精油是植物的次生代谢产物，生物化学的研究结果表明，植物遗传物质DNA中的碱基对的排列顺序不仅决定植物的形态、结构和遗传，而且决定植物代谢产物的积累。植物主要通过醋酸-丙二酸途径产生酚类等化合物，甲羟二戊酸途径产生萜类等化合物[4，6]。桦木科桦木属芳香植物白桦树叶可提取精油[8]。木醋液和精油都是植物资源产品，均具有抑菌、抗氧化等生物活性，常应用于药品、食品、化妆品等领域。笔者以白桦树叶为原料，采用多相同时蒸馏萃取法提取白桦叶精油，研究了其抑菌、抗氧化活性，并通过气相色谱-质谱法测定了白桦叶精油的挥发性化学成分，以期为同一种芳香植物的综合加工利用以及木醋液、精油等高附加值植物天然产品的加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料。

白桦鲜叶于2014年6月采自东北林业大学校园，采集树种经鉴定为白桦。

1.1.2 试剂。酵母膏、蛋白胨、琼脂均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;石油醚、氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁为分析纯，均购自天津市东丽区天大化学试剂厂;甲醇为色谱纯，购自天津科密欧化学试剂有限公司。

1.1.3 供试细菌。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均由东北林业大学实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 白桦叶精油的提取。

采用多相同时蒸馏萃取法。称取100 g白桦鲜叶，加入1 L蒸馏水于左侧的物料瓶中，在多相同时蒸馏萃取装置另一侧的圆底烧瓶中加入100 ml石油醚。同时蒸馏萃取4 h，旋转薄膜蒸发除去石油醚。称量所得精油质量，计算得率。

1.2.2 白桦叶精油的抑菌活性试验。

采用滤纸片法和平板菌落计数法[9]。最低抑菌浓度测定采用二倍稀释法，根据预试验结果，以丙酮为溶剂将白桦叶精油配制成0.200 00、0.100 00、0.050 00、0.025 00、0.012 50、0.006 25 g/ml 6个浓度的精油溶液。用直径6 mm的已灭菌的滤纸片蘸取不同浓度的精油溶液贴于带菌平板上，操作同抑菌活性试验。3次重复，放入人工气候箱37 ℃下培养24 h，以最小抑菌圈直径对应的待测液浓度作为该菌种的最低抑菌浓度。

1.2.3 白桦叶精油的抗氧化活性试验。

1.2.3.1 总还原能力测定。

根据文献[10]，取1.0 ml不同浓度的精油样液及抗坏血酸于试管中，依次加入2.5 ml 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.6）和2.5 ml质量分数1%的铁氰化钾溶液，混匀后于50 ℃水浴中保温20 min，快速冷却，再加入2.5 ml质量分数10%的三氯乙酸，离心10 min，取上清液2.5 ml，依次加入2.5 ml蒸馏水、0.5 ml质量分数0.1%的三氯化铁，充分混匀，在700 nm波长下测定吸光度（以蒸馏水作调零空白）。每个点平行操作3次，取平均值。

1.2.3.2 DPPH自由基清除率测定。

测定方法参照文献[11-12]，分别移取1.0 ml不同浓度的供试样液及抗坏血酸于试管中，加入3.0 ml 0.000 1 mol/L DPPH自由基溶液，立即混匀，室温放置15 min，测定517 nm波长下的吸光度（Ai），同时测定1.0 ml样液加入3.0 ml无水乙醇的吸光度（Aj）及1.0 ml无水乙醇加入3.0 ml DPPH自由基溶液的吸光度（A0）。以1.0 ml蒸馏水和3.0 ml无水乙醇混合液作空白。每个点平行操作3次，取平均值。根据下式计算试样对DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

1.2.3.3 羟自由基清除率测定。

向试管中依次加入1 mmol/L FeSO4溶液1.0 ml、不同浓度样液1.0 ml、1 mmol/L H2O2 1.0 ml、3 mmol/L水杨酸溶液2.0 ml，混匀，室温下放置30 min，于510 nm波长处测定吸光度（Ai），用蒸馏水代替水杨酸测定吸光度（Aj），用蒸馏水代替样液测定吸光度（A0）。每个点平行操作3次，取平均值。根据下式计算试样对羟自由基清除率：

羟自由基清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

1.2.4 白桦叶精油的GC-MS分析测定。

用甲醇将木醋液配制成浓度为10 μg/ml的甲醇溶液，利用7890A-7000B型气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）分别对试样进行GC-MS分析。色谱分析条件：色谱柱为HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;检测器为FID检测器;初始温度40 ℃并保持2 min，以10 ℃/min 的升温速度升到280 ℃并保持2 min;进样口温度250 ℃，进样量1.0 μl，不分流，氦气载气，流速1 ml/min。质谱分析条件：EI电离源，接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，扫描范围30～500 u。

1.2.5 数据处理。

采用Excel 2007、SPSS 19.0等軟件进行数据统计分析、处理及图表的绘制。

2 结果与分析

2.1 白桦叶精油的抑菌活性 由表1可知，白桦叶精油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制作用，抑菌圈直径分别为11.90±2.17和（9.01±1.31）mm，对金黄色葡萄球菌（G+）的抑制效果优于大肠杆菌（G-）。白桦叶精油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为0.050和0.025 g/ml。

表1 白桦叶精油的抑菌活性

2.2 白桦叶精油的抗氧化活性

2.2.1 总还原力。具有还原能力的物质可通过提供氢质子将体系中铁离子还原，从而抑制自由基的产生，一些植物提取物的抗氧化能力与还原能力之间具有很好的相关性，因此可用还原能力评价抗氧化活性[13]。由图1可知，白桦叶精油、抗坏血酸随着浓度的升高总还原能力逐渐增强，且二者与总还原力之间存在显著的量效关系，在实测白桦叶精油浓度（10.00～100.00 mg/ml）、抗坏血酸浓度（0.01～0.10 mg/ml）时量效关系拟合线性方程分别为y=0.008 2x-0.062 9（R2=0.938 3）、y=11.56x-0.158 0（R2=0.947 6）。白桦叶精油EC50值为68.646 mg/ml，抗坏血酸EC50值为0.057 mg/ml。

图1 白桦叶精油和抗坏血酸的总还原力

2.2.2 DPPH自由基清除率。DPPH自由基的乙醇溶液呈

深紫色，加入自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系，故用比色法进行定量分析，评价样品的抗氧化活性[14]。从图2可知，抗坏血酸EC50值为0.020 mg/ml，参照文献[15]，天然产物白桦叶精油含有多种挥发性化学成分，白桦叶精油的DPPH自由基清除活性有待进一步研究。

2.2.3 羟自由基清除率。在生命活动的氧化代谢过程中不

图2 白桦叶精油和抗坏血酸的DPPH自由基清除活性

断产生各种自由基，其中羟自由基是体内最活泼的活性氧，可介导如引起脂质过氧化、造成细胞结构和功能的破坏等病理变化，甚至引起细胞损伤或死亡[16]。因此，羟自由基清除率是反映测试样抗氧化作用的重要指标。从图3可知，白桦叶精油对羟自由基具有较好的清除作用，清除作用随样液浓度的增加而增强，表现出良好的量效关系。当精油浓度为4.00 mg/ml时清除率达到85.06%，其EC50值为2.294 mg/ml;抗坏血酸EC50值为0.100 mg/ml。

图3 白桦叶精油和抗坏血酸的羟自由基清除活性

2.3 白樺叶精油的挥发性化学成分分析

通过同时蒸馏萃取法提取的白桦叶精油得率为（0.48±0.07）%。所得精油按“1.2.4”条件进行GC-MS分析，共鉴定出18种化合物，通过面积归一化法计算出各组分的GC含量。从表2可知，白

桦叶精油主要由烷烃类、酯类、酮类、酚类、醇类、醛类等化合物组成，GC含量最高的化合物是十一烷（58.02%），GC含量

表2 白桦叶精油的挥发性化学成分

较高的化合物为硬脂酸甲酯（6.97%）、棕榈酸甲酯（5.14%）、萘（2.64%）、2，4-二叔丁基苯酚（2.17%）、丙酸叶醇酯（0.85%）、1，2，4，5-四甲基苯（0.60%）等。十一烷存在于烤烟烟叶、烟气中;硬脂酸甲酯存在于烟叶中;萘用于防虫剂等;2，4-二叔丁基苯酚用于杀虫剂、抗氧剂等;丙酸叶醇酯具有青香、果香和甜香香气;1，2，4，5-四甲基苯具有类似樟脑的气味等[17]。

3 结论

采用多相同时蒸馏萃取法提取的白桦叶精油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抑制作用，抑菌圈直径分别为11.90±2.17和（9.01±1.31）mm;白桦叶精油对羟自由基具有较好的清除作用，其EC50值为2.294 mg/ml。

白桦叶精油主要由烷烃类、酯类、酮类、酚类、醇类、

醛类等化合物组成，GC含量最高的化合物是十一烷（58.02%），GC含量较高的化合物为硬脂酸甲酯（6.97%）、棕榈酸甲酯（5.14%）、萘（2.64%）、2，4-二叔丁基苯酚（2.17%）、丙酸叶醇酯（0.85%）、1，2，4，5-四甲基苯（0.60%）等。白桦叶精油在抑菌和抗氧化等深加工产品领域具有潜在的开发价值。

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