基于活的但非可培养细菌降解毒死蜱的研究

吴咚咚 王强 蔡慧慧 施洁莹 付惠玲 王新全 周育 丁林贤

摘要 [目的]探索降解毒死蜱的新的微生物资源。[方法]应用最大或然数（MPN）法，通过添加适量复苏促进因子（Rpf）从多种土壤及污水生物处理系统中分离活的非可培养（VBNC）资源菌种，根据文献报道的已知毒死蜱降解菌株的系统关系综合分析，初步筛选出与已知降解毒死蜱菌种近缘的VBNC菌株并进行降解试验。[结果]共筛选出6株具有毒死蜱降解能力的菌株，其中菌株CHZYR63对毒死蜱的生物降解能力最强，经Box-behnken响应面法优化后降解率可达70.15%。[结论]可培养化VBNC菌种资源在残留农药降解方面有较大的利用价值，为揭示受染环境中VBNC微生物的形成及其活性化、环境污染物质的共代谢等微生物群体的相互作用机制提供了参考。

关键词 Rpf;VBNC;毒死蜱;生物降解;响应面法

中图分类号 S182;X172 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11711-04

Research on Viable but Non-culturable Bacteria in Chlorpyrifos Degradation

WU Dong-dong1，WANG Qiang2，CAI Hui-hui1，DING Lin-xian1* et al

（1. College of Geography and Environmental Science，Zhejiang Normal University，Jinhua， Zhejiang 321004;2. Institute of Quality and Standard for Agro-products， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou， Zhejiang 310000）

Abstract [Objective] The aim was to explore new microbial resources to degrade Chlorpyrifos. [Method] Using MPN system， some strains of the VBNC（viable but non-culturable）bacteria which could degrade Chlorpyrifos were isolated from soil and sewage biological treatment system through adding with some Rpf （resuscitation promoting factor）. [Result] Total six strains of the VBNC were obtained， among them the biodegradability of strain CHZYR63 could reach 70.15% through the analysis of Box-behnken response surface method. [Conclusion] The culturable VBNC bacteria not only have great value in degrading pesticide residues，but also provide important ideas and methods on revealing the formation mechanism and recovery mechanism of VBNC bacteria in polluted environment and total metabolism of environmental pollutants and interaction mechanism of the microbial population.

Key words Resuscitation promoting factor; Viable but non-culturable bacteria; Chlorpyrifos; Biodegradation; Response surface method

基金項目 国家高技术研究发展计划（863）项目（2011AA100806）;国家自然科学基金项目（31340071）;浙江省自然科学基金项目（LY13C010002）。

作者简介 吴咚咚（1986-），男，浙江苍南人，硕士研究生，研究方向：环境微生物技术。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事环境微生物研究。

鸣 谢 试验过程中，得到日本东京大学分子与细胞生物学研究所横田明教授提供的Micrococcus luteus菌种，在此致谢！

收稿日期 2014-10-09

利用纯培养技术从土壤、活性污泥、海水、湖水、沉淀物等自然界中分离到的微生物只占微生物总数的0.01%～10.00%，尚有90%以上的微生物处于未培养或活的但非可培养[1]状态而未被广泛认知。随着现代生物技术的发展，多种分子生物学研究方法为认识更多的VBNC状态菌提供了可能[2]。非培养手段虽可获取大量的有关微生物多样性及菌群的组成信息，但微生物相关生物学以及生态学功能的研究仍然受到许多限制。因此，应用Rpf[3]分离培养作为绝大部分微生物资源的VBNC状态菌及探索其潜在的相关功能，将为重新认识和评价微生物在食品发酵、农业、环保等领域的作用提供新的科学依据，赋予其更广阔的开发应用前景[4-5]。面对日益严重的有机磷农药（尤其是毒死蜱等持久性污染物） 污染问题，研究污染物胁迫下细菌进入VBNC状态的生存机制、关注VBNC 状态菌的可培养化，特别是其潜在环境功能的研究，将为受污环境的微生物修复开拓新的应用前景[6]。

毒死蜱是目前全世界生产和销售量最大的杀虫剂品种之一，也是世界卫生组织唯一许可的有机磷品种，现已在我国、美国、澳大利亚、日本等14个国家登记和注册[7]。毒死蜱在我国产销量逐年增加而且使用范围不断扩大，随之而来的毒死蜱生产和使用过程中带来的环境压力已不能忽视，其主要特点是在自然环境中的半衰期较长，为10～120 d，其中间体之一的三氯吡啶醇钠（TCP）具有抑菌活性，为生物难降解物质，易在农作物和蔬菜中残留，从而对人体造成损害[8]。2000年，美国环境保护局（EPA）指出毒死蜱可能对人的神经系统和脑部发育有潜在伤害，对儿童健康不利，宣布禁止在美国家庭和庭院内使用毒死蜱，并同时减少它在其他领域的使用[9]。因此，如何有效地应对毒死蜱的毒性和残留带来的污染，成为当前亟待解决的问题。由于毒死蜱特殊的化学结构和代谢产物TCP，传统的物理、化学、物理化学处理法及其综合利用均因存在低效以及二次污染问题限制了其在毒死蜱污染环境修复中的应用[10]。国内外研究表明，微生物降解治理技术安全、高效、经济，生物降解是控制和去除毒死蜱残留的有效途径之一。毒死蜱作为有机磷水解酶难以作用的一种底物，属于难以生物降解的物质，因此，分离筛选具有真正高效降解能力的微生物难度较大。随着毒死蜱的大量生产和广泛使用，其污染也势必会越来越严重，分离筛选和构建高效毒死蜱降解菌成为修复毒死蜱污染环境的关键所在[11]。为此，笔者基于在多种土壤及污水生物处理系统中利用MPN体系，添加适量Rpf[3]从中分离取得VBNC资源菌种，根据文献报道的已知毒死蜱降解菌株的系统关系综合分析，初步筛选了与已知降解毒死蜱菌种近缘的VBNC菌株并进行了降解试验，以期为降解毒死蜱提供新的微生物资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

供试菌株。分离自沙漠极限环境土壤、制药、印染以及城市污水处理系统中的可培养化VBNC菌株。

1.1.2

主要试剂与仪器。

99.8%毒死蜱标品（Sigma公司）、48%毒死蜱乳油（陶氏公司）、Rpf（实验室制备）、正己烷（分析纯）、甲醇（色谱纯）、无水硫酸钠（分析纯）等试剂。仪器包括高速冷冻离心机（5430R，Eppendorf公司）、电子天平（BSA822-CW，Sartorius公司）、电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9240，上海精宏实验设备有限公司）、立式圆形压力蒸汽灭菌锅（LS-B50L，上海医用核子仪器厂）、隔水式恒温培养箱（GNP-9160，上海精宏实验设备有限公司）、恒温摇床（YG-B，江苏太仓实验设备厂）、精密pH计（pH-3B，上海雷磁仪器厂）、酶标仪（1510，Thermo公司）、紫外分光光度计（Spectrum-1920）和Labsolution GC-2000气相色谱分析（日本岛津公司）。

1.1.3

培养基。富营养培养基：蛋白胨5.0 g，酵母3.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g， 2%琼脂，pH7.0，定容至1 L。

唯一磷源培养基：NaCl 1.0 g，（NH4）2NO3 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH7.0，定容至1 L。

唯一碳源培养基：NaCl 0.5 g，（NH4）2NO3 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO4.7H2O 0.5 g，pH7.0，定容至1 L。无机盐培养基：K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.5 g，NH4NO3 1.5 g，pH7.0，定容至1 L。

少量碳源培养基：K2HPO4 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.5 g，NH4NO3 1.5 g，加1%酵母抽提液，pH7.0，定容至1 L。

毒死蜱（定量）溶于正己烷（定量），经0.22 μm滤膜过滤并灭菌后加入培养基中（终浓度）。

1.2 方法

1.2.1

VBNC菌的分离和纯化。

采用MPN法，设计培养基中含Rpf的处理组与不含Rpf的对照组，以10倍稀释梯度以及重复3次构建MPN培养系，在30 ℃恒温条件下培养4～5 d，肉眼观察培养基有无混浊，并用酶标仪测定浑浊培养液的OD值。根据稀释段的浑浊情况，查对MPN值表，计算单位样品中处理组与对照组的可培养化细菌总数，判断Rpf对VBNC细菌的复苏生长作用。然后对判断为Rpf有效的处理组浑浊培养液进行稀释平板涂布分离，于30 ℃恒温培养箱中培养。挑取单菌落获得纯化的菌株。将纯化得到的细菌进行扩大培养，并用10%甘油将菌液冷冻在-80 ℃下保存。

1.2.2

毒死蜱的定量与降解菌降解能力的测定。

1.2.2.1

毒死蜱气相色谱条件的设置。进样口温度为 300 ℃;烘箱温度为程序升温：起始温度180 ℃，保留2 min，然后以 10 ℃/min的速率升至280 ℃，保留10 min;ECD 检测器温度330 ℃;载气为N2，柱流速为 19.9 ml/min;进样量：1 μl;分流比7∶1。

1.2.2.2

毒死蜱定量方法的确定。

设置3个独立重复试验， 每个重复试验在相同的培养条件下进行，采用正己烷作为萃取剂，在样品中加入等體积的正己烷，手动振荡将二者充分混匀，然后静置1 h，待有机相和水相完全分离后，进行毒死蜱萃取，取出上层的有机相溶液，重复萃取1次，合并提取液，经无水硫酸钠脱水后（真空冷冻近干，再用氮吹，重溶于等体积正己烷中）用0.22 μm滤膜过滤，使用紫外分光光度计（293 nm）和气相色谱确定毒死蜱的残留量及其降解率。

1.2.2.3

可培养化VBNC菌对毒死蜱降解能力的测定。

将细菌从斜面接种到平板（固体营养培养基、唯一磷源培养基、唯一碳源培养基、少量碳源培养基），30 ℃下培养24 h，然后转接于液体培养基（5 ml），30 ℃、160 r/min摇床振荡培养24 h，取60 μl培养液，加入5 ml毒死蜱含量为100 mg/L的液体营养培养基培养7 d。检测毒死蜱的残留含量。

1.2.3

响应面设计。

响应面法（RSM）能够对影响降解效率的因子水平及其交互作用进行优化与评价[12]，从而在各因素水平的响应值基础上找出预测的响应最优值以及相应的试验条件[13-14]。该试验运用Design-Expert8.0软件中的Box-behnken Design（BBD）程序进行响应面设计，以确定菌株CHZYR63（Pseudomonas fluorescens）降解毒死蜱的最优条件。具体因素及水平设计见表1。

表1 Box-behnken试验设计

2 结果与分析

2.1 紫外分光光度计法测定毒死蜱残留

用正己烷配制一系列浓度的毒死蜱溶液：5、10、20、30、40、50、60、80、100、140 mg/L;用紫外分光光度计（293 mn）测定并计算毒死蜱含量。毒死蜱浓度与相应吸光度的线性回归方程为y=0.017 7x+0.003 2，相关系数R2=0.998 5 （图1）。

图1 毒死蜱在正己烷中的标准曲线

在普通培养基中分别添加5、50、100 mg/L的毒死蜱，然后对普通培养基中的毒死蜱进行萃取回收试验，利用紫外分光光度计对毒死蜱含量进行检测，每个浓度进行3个平行试验。

从表2可知，毒死蜱的回收率随添加浓度的增加而减少，普通培养基中的回收率范围是95.7%～118.0%，相对标准偏差在5.4%～6.7%[9]。试验结果表明，分析方法的准确度和精密度能够满足菌株降解农药残留分析的要求。因此，上述无机盐培养基中毒死蜱的检测方法符合农药残留分析标准的要求，可用于毒死蜱的定量试验中。

表2 毒死蜱在培养液中的添加回收率

2.2 气相色谱法测定毒死蜱残留量

用正己烷配制一系列标准浓度的毒死蜱溶液：5、10、20、30、40、50、60、80、100 mg/L;然后在“1.2.2.1”气相色谱条件下测定毒死蜱含量。毒死蜱浓度与相应吸光度的线性回归方程为y=24 203x+612 212，相关系数R2=0.995 3（图2）。

图2 毒死蜱GC-ECD标准曲线

2.3 可培养化VBNC菌株的初步筛选

2.3.1

毒死蜱降解性菌株的初步筛选。分别从多种土壤、印染和制药以及城市污水处理系统中分离到数十株可培养化VBNC菌株，经检索初步筛选出与已知降解毒死蜱关联菌种近缘的VBNC菌种14株作为试验菌株（表3）。

表3 已知降解毒死蜱关联菌种近缘的VBNC菌种

注：表中可培养化VBNC菌株的分离源均为制药污水。

2.3.2

菌株在不同培养基中的降解能力。结果表明，CHZYN52在少量碳源培养基中的降解率最高，为70.48%，而CHZYN63在富营养培养基中降解率最高，为61.48%，唯一磷、碳培养基中各菌株降解率均较低（图3）。

图3 菌株在各培养基下的降解率

2.3.3

响应面分析及结果。

根据试验设计表得到17组不同的试验组合，分别对该17组试验进行毒死蜱降解效率的测定，得到每个试验的毒死蜱降解率值（表4），并对结果进行方差分析及二次多项回归拟合。

表4 Box-Behnken 试验结果

结果表明， 模型Prob>F 值小于0.05，说明该模型显著。模型失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，模型失拟项的Prob>F 值小于0.01，模型的相关系数R2=0.991 8，校正系数RAdj2=0.985 5，说明该模型比较合适[20]。经软件分析得到毒死蜱降解率对农药浓度、温度和pH的多元回归方程：

Y=55.82+13.39A-6.44B+10.63C+1.84AB+9.58AC+6.57BC-30.71A2-12.27B2-11.17C2

为了进一步研究相关变量之间的交互作用并确定其最优点， 用Design-Expert 软件绘制2个关键影响因素对毒死蜱降解交互影响的曲面图。从图4可知，毒死蜱降解率达到预测最大值时的条件为：毒死蜱浓度131 mg/L，pH9.0，培养温度29 ℃，预测最高降解率可达68.00%。

图4 毒死蜱浓度和pH交互作用的响应面

将菌株CHZYR63接种到含有131 mg/L毒死蜱的pH为9的富营养培养基中，在29 ℃下进行培养。经测定培养基中毒死蜱的浓度变化可知，菌株CHZYR63对毒死蜱的降解率可达到70.15%。试验验证该设计方法切实可行，条件优化后的毒死蜱的降解率为70.15%，与模型预测值相当接

近。VBNC菌株對毒死蜱的降解能力尚未见相关报道。通过BBD响应面法试验设计，优化CHZYR63菌株对毒死蜱的降解条件，通过降解特性研究，可以得知培养7 d后，CHZYR63菌株在29 ℃、pH为9、毒死蜱初始浓度为131 mg/L的最适条件下，对毒死蜱的降解率可达70.15%。结果表明，毒死蜱降解条件的优化能够促进可培养化VBNC菌株CHZYR63对毒死蜱的生物降解，提高毒死蜱的降解效率。

3 讨论

试验应用Micrococcus luteus所分泌的Rpf从多种环境中分离到经复苏活化的可培养化VBNC菌种，初次从VBNC菌中筛选到6株具有降解毒死蜱能力的菌株：CHZYN52、ZYSR62、CHZYR63、CHZYR61、CHZYR52和ZYSR66，分别属于Pseudomonas putida、Agrobacterium albertimagni、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas stutzeri、Moraxella osloensis、Agrobacterium tumefaciens的近缘菌种。其中以属于Pseudomonas fluorescens的菌株CHZYR63具有较高的降解效果，显示出可培养化VBNC菌种的实际应用价值。因此，基于环境功能及微生物资源角度，展开Rpf 复苏VBNC状态菌的研究，对于寻找新的菌种资源及潜在的环境功能菌群具有重要意义，同时为重新认识和评价微生物在污染环境修复、环境保护领域的作用提供新的理论依据。

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