乌司他丁对脓毒症大鼠脑组织的保护作用

曾朝涛 张萌 周天恩 蒋龙元

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.08.013

基金項目：广东省自然科学基金（06021323）

作者单位：510120 广州，中山大学附属孙逸仙纪念医院急诊医学科

通信作者：蒋龙元，Email：jly@China-em.com

【摘要】目的 观察乌司他丁对脓毒症大鼠血脑屏障及脑细胞凋亡的影响。

访法 清洁级雄性SD大鼠52只，随机（随机数字法）分为6组。假手术（Sham）6 h组、24 h组，每组6只；脓毒症（CLP）及乌司他丁（UTI）6 h组、24 h组，每组10只。Sham组只开腹后关腹，CLP组及UTI组用盲肠结扎穿孔法（CLP）建立脓毒症模型，UTI组建模后1 h股静脉注射乌司他丁50 000 U/kg，其他组注射等容量生理盐水。各组在建模后6 h、24 h断脑取材，取材前进行神经功能缺损评分，取材后HE染色、称量脑干湿质量、伊文思蓝渗透法测定血脑屏障通透性，TUNEL免疫荧光检测脑细胞凋亡。应用SPSS 13.0软件统计学分析，多组比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

结果 UTI组大鼠神经功能评分低于Sham组（P<0.05），高于CLP组（P<0.05）。光镜下CLP组大鼠神经细胞变性、坏死、水肿较UTI组明显。CLP 24 h组大鼠血脑屏障通透性较UTI 24 h组显著升高（P<0.05）。CLP组大鼠脑细胞凋亡数较UTI组显著增多（P<0.05）。

结论 乌司他丁通过减轻血脑屏障损伤，抑制脑细胞凋亡，对脓毒症大鼠脑组织起保护作用。

【关键词】脓毒症；脑损伤；盲肠结扎穿孔；乌司他丁；伊文思蓝；血脑屏障；免疫荧光；凋亡

Protective effect of ulinastatin on cerebral tissue in septic rats Zeng Chaotao， Zhang Meng， Zhou Tianen， Jiang Longyuan. Emergency Department of Sun Yat-Sen Memorial Hospital Afflicted to Sun Yat-Sen University， Guangzhou 510120， China.

Corresponding author： Jiang Longyuan， Email： jly@China-em.com

【Abstract】Objective To explore the effect of Ulinastatin on blood brain barrier （BBB） and apoptosis of neural cells in septic rats. Methods Fifty-two clean level male Sprague-Dawley rats were randomly（random number table） divided into six groups： Sham groups at 6 h and 24 h， each group with six rats. Sepsis groups（CLP） and Ulinastatin treated groups （UTI） at 6 h and 24 h， each group with ten rats. In CLP and UTI groups， cecal ligation and puncture （CLP） were performed to induce sepsis. Sham group was only opened and closed abdomen. Ulinastatin （50 000 U/kg） was administered via femoral vein 1 h after CLP. The same volume of saline instead of Ulinastatin was administered in Sham and CLP groups. The neurological status was assessed by Neurological Deficit Scale Scores （NDSS） at 6 h and 24 h after CLP. Then the brain was harvested for HE staining and weighing water content. The BBB permeability was assayed by Evans Blue dye extravasations. Apoptosis of neural cells were detected by TUNEL immune fluorescence. Statistical analysis was performed with SPSS version 13.0， ANOVA was used for multiple groups comparison and t-test for paired comparison. Results TheNeurological Deficit Scale Scores of UTI group was lower than Sham group（P<0.05） but higher than that of CLP group（P<0.05）. Swelling， degeneration and edema were observed in cerebral cortex and hippocampal neurons in CLP group through light microscope， and were more serious than those in UTI group. Compared with UTI 24 h group， BBB permeability of CLP 24 h group significantly rose（P<0.05）. The number of apoptosis of neural cells increased more in CLP group than it did in UTI group （P<0.05）. Conclusions Ulinastatin could protect the cerebral tissue in septic rats by alleviating the damage of BBB and reducing the apoptosis of neural cells.

【Key words】Sepsis； Cerebral injury； Cecal ligation and puncture； Ulinastatin； Evans blue； Blood brain barrier； Immune fluorescence； Apoptosis

脓毒症脑病是脓毒症的常见并发症，其严重程度与患者的病死率正相关^[1]。目前并无特殊针对脓毒症脑病的治疗措施。乌司他丁是从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的一种蛋白酶抑制剂，具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶释放，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用，研究发现乌司他丁对脓毒症多器官有保护作用^[2-4]，但对脑组织影响的研究较少。本文试图探讨乌司他丁对脓毒症大鼠脑组织是否有保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型制备

动物模型在中山大学动物实验中心完成，切片染色在中山大学病理学实验室完成。清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠52只，体质量200～250 g，由中山大学实验动物中心提供。用数字表法随机分为6组，假手术（Sham） 6 h、24 h组，每组6只；脓毒症组（CLP） 6 h、24 h组及乌司他丁（UTI）6 h、24 h组，每组10只。在标准饲养条件下适应1周，术前自由进食进水。大鼠称质量后二氧化碳诱导麻醉，10%水合氯醛3.0 mL/kg腹腔麻醉，备皮，固定大鼠，0.2%碘伏消毒皮肤，沿腹白线作长约2～3 cm切口，在左下腹找到盲肠，提拉出盲肠，取中点位置，4号丝线穿过盲肠血管弓内结扎盲肠。18号粗针头盲肠结扎段贯穿2孔，两孔间相距约1～1.5 cm，各穿1条2 mm宽橡皮条引流、将盲肠回纳腹腔，缝合腹壁。术后钝性分离左侧股静脉，结扎远心端，眼科剪剪出一侧口，置入肝素化的23号聚乙烯管，深度约3～5 cm，回抽见血后结扎近心端。假手术组只开腹后关腹，其他操作均类同。术后1 h，UTI组股静脉注射乌司他丁50 000 U/kg，Sham及CLP组注射等剂量生理盐水。术后大鼠置于笼内自由进食水，术后6 h成模，成模标准包括一般状态、肛温、白细胞计数、存活率，参见文献[5]。各组6 h成活率100%，24 h CLP组存活率85%，其他两组存活率100%。

1.2 实验方法

1.2.1 取材及HE染色 各组按6 h、24 h时间点取材，取材前进行神经功能缺损评分。10%水合氯醛3.0 mL/kg麻醉后，颈动脉置管。剪开上腔静脉，4%多聚甲醛50 mL颈动脉灌注15～20 min，断头开颅取脑，4%多聚甲醛4 ℃固定24 h以上。石蜡包埋、切片、HE染色。

1.2.2 脑干湿重及伊文思蓝渗透法测定血脑屏障通透性 大鼠处死前1 h麻醉后经股静脉置管注射2%伊文思蓝（MP biomedicals，美国）2 mL/kg，处死前经颈动脉置管灌注生理盐水至上腔静脉流出澄清液体。冰盘上断头取脑，取左半大脑部分脑组织滤纸吸干表面水分后称质量，置于80 ℃鼓风干燥箱中，烘干48 h，测脑干质量。脑含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。将右半大脑的皮质、海马分离开，用电子天秤分别精确称重后置于甲酰胺中，37 ℃水浴48 h后取出，离心20 min，取上清液Nanodrop2000紫外分光光度计（Thermo scientific公司，美国） 620 nm测定光密度，根据标准曲线求得伊文思蓝含量^[8]。

1.2.3 TUNEL免疫荧光检测脑细胞凋亡 使用TUNEL试剂盒（默克生物科技公司，德国）检测脑细胞凋亡，石蜡切片样本脱蜡水化，20 μg/mL的蛋白酶K溶液覆盖标本，室温孵育20 min，TBS洗3 min×2次，每个样本用20 μL TdT平衡缓冲液室温孵育30 min，加入57 μL荧光素片段末端标记反应混合物和3 μLTdT酶37 ℃恒溫培养箱避光孵育90 min。TBS溶液室温孵育2 min×2次，逐滴加入含DAPI的Mounting Media 封片剂封片。绿色荧光滤光片，在465～495 nm 波长下观察被标记的凋亡细胞。用蓝色荧光滤光片，在330～380 nm波长下，观察DAPI标记的全体细胞。在每张切片随机选择5个视野（×200倍）计数凋亡细胞数，求其平均值。

1.3 统计学方法

数据以均数±标准差（x±s）表示，使用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料多组间的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分

CLP术后大鼠可见明显的竖毛、懒动、拒食、多饮。CLP组及UTI组神经功能明显差于Sham组（P<0.01），UTI 6 h组神经功能评分高于CLP 6 h组（P<0.05），UTI 24 h组与CLP 24 h组差异无统计学意义。见表1，图1。2.2 脑组织病理变化

CLP组较UTI组见大量嗜曙红样及核固缩的神经细胞（↑），明显的神经细胞及血管周围水肿（*），较多的血管周围炎性细胞浸润（∧），CLP 6 h组最明显。见图2～3。

2.3 脑含水量检测

CLP 6 h组脑水肿最明显（P<0.05），UTI 6 h组脑水肿较CLP 6 h组轻（P<0.05）。24 h各组脑水肿差异无统计学意义。见图4和表3。

2.4 血脑屏障通透性比较

6 h各组间大鼠血脑屏障通透性差异无统计学意义。24 h建模组血脑屏障通透性升高，CLP 24 h组血脑屏障通透性较UTI 24 h组显著升高（P<0.05）。见图5和表4。

2.5 神经细胞凋亡比较

Sham组见少量神经细胞凋亡，CLP 6 h组较UTI 6 h组凋亡明显（P<0.01）。CLP 24 h组及UTI 24 h组细胞凋亡减少，两组间差异无统计学意义，但明显多于Sham组（P<0.01）。见图6～7和表5。

TNF-α可以诱导BBB血管内皮细胞间黏附分-1（ICAM-1） 的表达，促进粒细胞及血浆白蛋白进入脑组织，加重组织水肿^[8]。TNF-α与星形胶质细胞的肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）结合，诱导水通道蛋白-4（AQP-4）表达，引起脑组织水肿^[9]。另外，TNF-α激活星形胶质细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）导致过量NO产生，NO可以和O₂-直接相互作用形成过氧亚硝酸盐和活性氧一起进一步放大细胞氧化应激反应，破坏血脑屏障内皮细胞^[10]。本研究发现乌司他丁可减轻CLP大鼠脑组织水肿及BBB损伤。其机制可能与其抑制TNF-α生成进而减少ICAM-1、AQP-4、iNOS等细胞因子的表达及减少活性氧生成有关^[11-14]。

脓毒症引起神经细胞凋亡的机制尚未明确。有研究发现脓毒症早期，大鼠脑组织线粒体可逆性功能损伤，线粒体于LPS注射3 h开始出现损伤，24 h趋于恢复。线粒体损伤后释放细胞色素C进入胞浆，诱导脓毒症大鼠凋亡基因bax表达，最终激活caspase-3引起神经细胞凋亡。因此乌司他丁抑制脓毒症脑细胞凋亡机制可能与其保护内皮细胞及线粒体，减少细胞色素C释放引起bax基因激活有关。本研究发现乌司他丁可减少脓毒症大鼠脑细胞的凋亡，改善神经功能，脓毒症6 h较明显，24 h组保护作用不明显，可能与乌司他丁半衰期较短，本实验用药仅为术后注射1次有关。

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（收稿日期：2013-12-29）

（本文编辑：何小军）

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