D型产气荚膜梭菌ε毒素蛋白结构及抗原表位分析

冶贵生等

摘要：利用生物软件对D型产气荚膜梭菌ε毒素的蛋白结构、抗原表位进行预测与分析。综合ε毒素蛋白亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构预测结果显示，肽链13-19、44-47、59-63、79-82、94-97、151-153、200-204、211-221、245-250、257-260位可能存在B细胞抗原表位，三级结构预测的94、151结合位点位于94-97、151-153抗原表位区内。

关键词：D型产气荚膜梭菌；ε毒素；表位；蛋白结构

中图分类号：S852.61 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3852-03

Abstract： The protein structure and epitope of ε toxin of Clostridium perfringens type D were predicted and analyzed with biological software. The results of hydrophilicity， surface possibilities，antigen index and secondary structure showed that there were exist antigen epitope of B cell at 13-19， 44-47， 59-63， 79-82， 94-97， 151-153， 200-204， 211-221， 245-250 and 257-260 position of peptide chain. The 94，151 binding sites predicted by tertiary structure were located in the 94-97，151-153 position.

Key words： Clostridium perfringens type D； ε toxin； epitope； protein structure

D型产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性菌，产芽孢，严重危害养羊业，其引起的疾病潜伏期短，发病快，死亡快[1]。ε毒素是D型产气荚膜梭菌致病的主要毒素之一，ε毒素前体被激活后会对细胞产生毒性并增加血管渗透性[2]。ε毒素重组表达的研究表明，毒素蛋白可与抗血清结合[3]，表达产物免疫试验动物可以起到免疫保护的作用[4，5]，但目前ε毒素重组表达的研究中涉及毒素抗原表位的很少。因此，本研究在前期研究基础上[6，7]，采用多方案预测方法对D型产气荚膜梭菌ε毒素的结构与抗原表位进行预测与分析，从而为下一步D型产气荚膜梭菌ε毒素表位疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

D型产气荚膜梭菌ε毒素基因序列来源于前期研究工作[7]。

1.2 方法

采用Garnier-Robson[8]、Chou-Fasman[9]、Karplus-Schulz[10]方法预测ε毒素的α螺旋、β折叠、β转角、无规则卷曲、柔韧性等二级结构；采用Kyte-Doolittle[11]方法预测其亲水性；采用Jameson-Wolf[12]方法预测其抗原指数；采用Emini[13]方法预测其表面可能性；采用I-Tasser在线服务器预测其三级结构。

2 结果与分析

2.1 ε毒素二级结构预测结果

Garnier-Robson方法预测结果表明（图1），ε毒素二级结构中α螺旋占0.766%，存在两处单氨基酸残基；β折叠占70.5%，在肽链中分布较多，主要分布区域为1-13，19-29，32-43，48-51，56-59，65-78，83-86，90-93，99-122，127-137，145-150，154-159，163-168，170-185，192-194，196-200，205-210，212-214，218-219，222-226，231-245，251-258，260-261；β转角占11.9%，在肽链中分布较少，主要分布区域为14-18，45-47，87-89，94-97，189-190，201-204，220-221，227-228，259-260；无规则卷曲占17.2%，在肽链分布较均匀，主要分布区域为30-31，52-54，60-64，79-81，123-124，138-144，151-152，160-162，186-188，215-217，229-230，246-250。

Chou-Fasman方法预测结果表明（图1），ε毒素二级结构中α螺旋占16.9%，在肽链中分布少且不均匀，存在6个区段，在肽链N-端分布较多，主要分布区域为21-29，34-40，67-70，72-78，83-88，235-245；β折叠占32.6%，在肽链中后部分布较多，主要分布区域为7-12，37-42，98-119，124-130，155-158，163-174，179-185，231-236，238-246，251-256；β转角占39.8%，在肽链中分布较丰富，分布较均匀，主要分布区域为3-6，17-20，30-33，43-50，63-66，79-82，89-92，94-97，120-123，131-134，137-144，151-154，159-162，175-178，187-190，193-196，200-203，208-211，213-216，218-221，227-230，247-250，257-260。

Karplus-Schulz方法预测结果表明（图1），ε毒素柔韧性区域较丰富，主要分布区域为5-9，11-19，24-28，39-48，53-63，77-92，94-106，108-112，123-127，130-132，137-147，151-155，161-163，172-180，183-195，200-204，209-230，244-252，且77-92，94-106，83-195，209-230四个区域连续分布跨度相对较大。

2.2 ε毒素亲水性预测结果

Kyte-Doolittle方法预测结果表明（图2），ε毒素的亲水性较高，分布区域较多，主要的分布区域为1-35，40-67，77-103，105-107，120-122，134-153，172-176，186-193，198-234，245-253，256-261，且1-35，40-67，77-103，134-153，98-234这几个分布区域，亲水性氨基酸残基连续分布相对较大。

2.3 ε毒素抗原指数预测结果

Jameson-Wolf方法预测结果表明（图3），ε毒素抗原指数正值分布区较多，主要分布区域为1-19， 24-31，40-50，52-66，71-72，77-100，122-126，137-156，173-179，186-195，199-205，208-230，239-241，244-252，256-261，且1-19，52-66，77-100，137-156， 208-230这几个分布区域， 抗原指数正值连续分布区相对较大。

2.4 ε毒素表面可能性预测结果

Emini方法预测结果表明（图4），ε毒素表面可能性的分布区域为1-3，5-6，13-31，44-47，54-56，59-63，65-68，79-90，95-98，103-105，130-132，136-147，150-152，200-204，211-221，228-230，244-247，249-251，258-261，其中13-31，79-90，136-147这几个区域，表面可能性连续分布范围相对较大。

2.5 ε毒素抗原表位预测结果

综合ε毒素亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构预测结果，ε毒素的13-19，44-47，59-63，79-82，94-97，151-153，200-204，211-221，245-250，257-260位氨基酸存在可能的B细胞抗原表位。

2.6 ε毒素三级结构预测结果

应用I-Tasser在线软件对ε毒素进行三级结构预测后得到一种模型（图5），该模型的C-score值为1.79，在置信区间内，模型可信度较高。三级结构预测的94，151结合位点位于“2.5”中94-97，151-153 预测区内。

3 讨论

抗原表位又称为抗原决定簇，是抗原分子表面具有特殊立体构型和免疫活性的化学基因[14]。在蛋白质二级结构中，由于α螺旋和β折叠结构不易形变，一般不作为抗原表位考虑，而β转角和无规则卷曲多出现在蛋白质表面，成为抗原表位的可能性较大。抗原表位预测时综合考虑白亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构等因素，可提高预测的准确性。本研究中D型产气荚膜梭菌ε毒素二级结构预测结果中，Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法预测的α螺旋均较少，且Garnier-Robson方法预测的α螺旋只是两处单个氨基酸，可以考虑Garnier-Robson方法预测ε毒素时不形成α螺旋。Chou-Fasman方法预测ε毒素形成的转角区较丰富，这些转角结构可能利于结合抗体。综合ε毒素亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构等预测结果，肽链13-19、44-47、59-63、79-82、94-97、151-153、200-204、211-221、245-250、257-260位氨基酸可能存在B细胞抗原表位，可作为表位疫苗设计时的选择区，且三级结构预测的94、151结合位点位于94-97、151-153预测区内，该区段称为抗原表位的可能性较大。

致谢：感谢韩志辉教授给予的指导与帮助。

参考文献：

[1] 陈敷言.兽医传染病学[M].第五版.北京：中国农业出版社，2006.

[2] MIYALMOTO O，MINAMI J，TOYOSHIMA T，et al.Neurotoxicity of clostridium perfringens epsilon toxin for the rat hippocampus via the glutamatergic system[J].Infect Immun，1998，66：2501-2508.

[3] 王 超，唐丽杰，葛俊伟，等.产气荚膜梭菌ε毒素突变基因的表达及其抗体中和效价测定[J].中国预防兽医学报，2013，35（6）：500-503.

[4] 王光华，蔺国珍，郑福英，等.D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究[J].中国畜牧兽医，2012，39（3）：36-41.

[5] 卢田粉，柴同杰，孙玲玉，等.产气荚膜梭菌ε毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究[J].中国畜牧兽医，2012，39（9）：59-62.

[6] 冶贵生，康耀鹏，张龙刚.D型产气荚膜梭菌主要毒素基因的PCR检测[J].黑龙江畜牧兽医，2012（2）：107-108.

[7] 冶贵生.D型产气荚膜梭菌青海分离株ε毒素遗传变异分析[J].湖北农业科学，2012，51（15）：3183-3185.

[8] GARNIER J，OSGUTHORPE D J，ROBSON B.Analysis of the accuracy and implications of simple method for predicting the secondary structure of globular proteins[J]. J Mol Biol，1978，120（1）：97-120.

[9] CHOU P Y，FASMAN G D.Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence[J].Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol，1978，47：45-148.

[10] KARPLUS P A，SCHULTZ G E.Prediction of chain flexibility in proteins[J].Naturwissenschaften，1985，72：212-213.

[11] KYTE J，DOOLITTLE R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J].J Mol Biol，1982，157（1）：105-132.

[12] JAMESON B A，WOLF H.The antigenic index：A novel algorithm for predicting antigenic determinants[J].Comput Appl Biosci，1988，4（1）：181-186.

[13] EMINI E A，HUGHES J V，PERLOW D S，et al.Induction of hepatitis a virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide[J].J Virol，1985，55（3）：836-839.

[14] 陆承平.兽医微生物学[M].第三版.北京：中国农业出版社，2001.

（责任编辑 程碧军）

2.2 ε毒素亲水性预测结果

Kyte-Doolittle方法预测结果表明（图2），ε毒素的亲水性较高，分布区域较多，主要的分布区域为1-35，40-67，77-103，105-107，120-122，134-153，172-176，186-193，198-234，245-253，256-261，且1-35，40-67，77-103，134-153，98-234这几个分布区域，亲水性氨基酸残基连续分布相对较大。

2.3 ε毒素抗原指数预测结果

Jameson-Wolf方法预测结果表明（图3），ε毒素抗原指数正值分布区较多，主要分布区域为1-19， 24-31，40-50，52-66，71-72，77-100，122-126，137-156，173-179，186-195，199-205，208-230，239-241，244-252，256-261，且1-19，52-66，77-100，137-156， 208-230这几个分布区域， 抗原指数正值连续分布区相对较大。

2.4 ε毒素表面可能性预测结果

Emini方法预测结果表明（图4），ε毒素表面可能性的分布区域为1-3，5-6，13-31，44-47，54-56，59-63，65-68，79-90，95-98，103-105，130-132，136-147，150-152，200-204，211-221，228-230，244-247，249-251，258-261，其中13-31，79-90，136-147这几个区域，表面可能性连续分布范围相对较大。

2.5 ε毒素抗原表位预测结果

综合ε毒素亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构预测结果，ε毒素的13-19，44-47，59-63，79-82，94-97，151-153，200-204，211-221，245-250，257-260位氨基酸存在可能的B细胞抗原表位。

2.6 ε毒素三级结构预测结果

应用I-Tasser在线软件对ε毒素进行三级结构预测后得到一种模型（图5），该模型的C-score值为1.79，在置信区间内，模型可信度较高。三级结构预测的94，151结合位点位于“2.5”中94-97，151-153 预测区内。

3 讨论

抗原表位又称为抗原决定簇，是抗原分子表面具有特殊立体构型和免疫活性的化学基因[14]。在蛋白质二级结构中，由于α螺旋和β折叠结构不易形变，一般不作为抗原表位考虑，而β转角和无规则卷曲多出现在蛋白质表面，成为抗原表位的可能性较大。抗原表位预测时综合考虑白亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构等因素，可提高预测的准确性。本研究中D型产气荚膜梭菌ε毒素二级结构预测结果中，Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法预测的α螺旋均较少，且Garnier-Robson方法预测的α螺旋只是两处单个氨基酸，可以考虑Garnier-Robson方法预测ε毒素时不形成α螺旋。Chou-Fasman方法预测ε毒素形成的转角区较丰富，这些转角结构可能利于结合抗体。综合ε毒素亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构等预测结果，肽链13-19、44-47、59-63、79-82、94-97、151-153、200-204、211-221、245-250、257-260位氨基酸可能存在B细胞抗原表位，可作为表位疫苗设计时的选择区，且三级结构预测的94、151结合位点位于94-97、151-153预测区内，该区段称为抗原表位的可能性较大。

致谢：感谢韩志辉教授给予的指导与帮助。

参考文献：

[1] 陈敷言.兽医传染病学[M].第五版.北京：中国农业出版社，2006.

[2] MIYALMOTO O，MINAMI J，TOYOSHIMA T，et al.Neurotoxicity of clostridium perfringens epsilon toxin for the rat hippocampus via the glutamatergic system[J].Infect Immun，1998，66：2501-2508.

[3] 王 超，唐丽杰，葛俊伟，等.产气荚膜梭菌ε毒素突变基因的表达及其抗体中和效价测定[J].中国预防兽医学报，2013，35（6）：500-503.

[4] 王光华，蔺国珍，郑福英，等.D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究[J].中国畜牧兽医，2012，39（3）：36-41.

[5] 卢田粉，柴同杰，孙玲玉，等.产气荚膜梭菌ε毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究[J].中国畜牧兽医，2012，39（9）：59-62.

[6] 冶贵生，康耀鹏，张龙刚.D型产气荚膜梭菌主要毒素基因的PCR检测[J].黑龙江畜牧兽医，2012（2）：107-108.

[7] 冶贵生.D型产气荚膜梭菌青海分离株ε毒素遗传变异分析[J].湖北农业科学，2012，51（15）：3183-3185.

[8] GARNIER J，OSGUTHORPE D J，ROBSON B.Analysis of the accuracy and implications of simple method for predicting the secondary structure of globular proteins[J]. J Mol Biol，1978，120（1）：97-120.

[9] CHOU P Y，FASMAN G D.Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence[J].Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol，1978，47：45-148.

[10] KARPLUS P A，SCHULTZ G E.Prediction of chain flexibility in proteins[J].Naturwissenschaften，1985，72：212-213.

[11] KYTE J，DOOLITTLE R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J].J Mol Biol，1982，157（1）：105-132.

[12] JAMESON B A，WOLF H.The antigenic index：A novel algorithm for predicting antigenic determinants[J].Comput Appl Biosci，1988，4（1）：181-186.

[13] EMINI E A，HUGHES J V，PERLOW D S，et al.Induction of hepatitis a virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide[J].J Virol，1985，55（3）：836-839.

[14] 陆承平.兽医微生物学[M].第三版.北京：中国农业出版社，2001.

（责任编辑 程碧军）

2.2 ε毒素亲水性预测结果

Kyte-Doolittle方法预测结果表明（图2），ε毒素的亲水性较高，分布区域较多，主要的分布区域为1-35，40-67，77-103，105-107，120-122，134-153，172-176，186-193，198-234，245-253，256-261，且1-35，40-67，77-103，134-153，98-234这几个分布区域，亲水性氨基酸残基连续分布相对较大。

2.3 ε毒素抗原指数预测结果

Jameson-Wolf方法预测结果表明（图3），ε毒素抗原指数正值分布区较多，主要分布区域为1-19， 24-31，40-50，52-66，71-72，77-100，122-126，137-156，173-179，186-195，199-205，208-230，239-241，244-252，256-261，且1-19，52-66，77-100，137-156， 208-230这几个分布区域， 抗原指数正值连续分布区相对较大。

2.4 ε毒素表面可能性预测结果

Emini方法预测结果表明（图4），ε毒素表面可能性的分布区域为1-3，5-6，13-31，44-47，54-56，59-63，65-68，79-90，95-98，103-105，130-132，136-147，150-152，200-204，211-221，228-230，244-247，249-251，258-261，其中13-31，79-90，136-147这几个区域，表面可能性连续分布范围相对较大。

2.5 ε毒素抗原表位预测结果

综合ε毒素亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构预测结果，ε毒素的13-19，44-47，59-63，79-82，94-97，151-153，200-204，211-221，245-250，257-260位氨基酸存在可能的B细胞抗原表位。

2.6 ε毒素三级结构预测结果

应用I-Tasser在线软件对ε毒素进行三级结构预测后得到一种模型（图5），该模型的C-score值为1.79，在置信区间内，模型可信度较高。三级结构预测的94，151结合位点位于“2.5”中94-97，151-153 预测区内。

3 讨论

抗原表位又称为抗原决定簇，是抗原分子表面具有特殊立体构型和免疫活性的化学基因[14]。在蛋白质二级结构中，由于α螺旋和β折叠结构不易形变，一般不作为抗原表位考虑，而β转角和无规则卷曲多出现在蛋白质表面，成为抗原表位的可能性较大。抗原表位预测时综合考虑白亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构等因素，可提高预测的准确性。本研究中D型产气荚膜梭菌ε毒素二级结构预测结果中，Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法预测的α螺旋均较少，且Garnier-Robson方法预测的α螺旋只是两处单个氨基酸，可以考虑Garnier-Robson方法预测ε毒素时不形成α螺旋。Chou-Fasman方法预测ε毒素形成的转角区较丰富，这些转角结构可能利于结合抗体。综合ε毒素亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构等预测结果，肽链13-19、44-47、59-63、79-82、94-97、151-153、200-204、211-221、245-250、257-260位氨基酸可能存在B细胞抗原表位，可作为表位疫苗设计时的选择区，且三级结构预测的94、151结合位点位于94-97、151-153预测区内，该区段称为抗原表位的可能性较大。

致谢：感谢韩志辉教授给予的指导与帮助。

参考文献：

[1] 陈敷言.兽医传染病学[M].第五版.北京：中国农业出版社，2006.

[2] MIYALMOTO O，MINAMI J，TOYOSHIMA T，et al.Neurotoxicity of clostridium perfringens epsilon toxin for the rat hippocampus via the glutamatergic system[J].Infect Immun，1998，66：2501-2508.

[3] 王 超，唐丽杰，葛俊伟，等.产气荚膜梭菌ε毒素突变基因的表达及其抗体中和效价测定[J].中国预防兽医学报，2013，35（6）：500-503.

[4] 王光华，蔺国珍，郑福英，等.D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究[J].中国畜牧兽医，2012，39（3）：36-41.

[5] 卢田粉，柴同杰，孙玲玉，等.产气荚膜梭菌ε毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究[J].中国畜牧兽医，2012，39（9）：59-62.

[6] 冶贵生，康耀鹏，张龙刚.D型产气荚膜梭菌主要毒素基因的PCR检测[J].黑龙江畜牧兽医，2012（2）：107-108.

[7] 冶贵生.D型产气荚膜梭菌青海分离株ε毒素遗传变异分析[J].湖北农业科学，2012，51（15）：3183-3185.

[8] GARNIER J，OSGUTHORPE D J，ROBSON B.Analysis of the accuracy and implications of simple method for predicting the secondary structure of globular proteins[J]. J Mol Biol，1978，120（1）：97-120.

[9] CHOU P Y，FASMAN G D.Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence[J].Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol，1978，47：45-148.

[10] KARPLUS P A，SCHULTZ G E.Prediction of chain flexibility in proteins[J].Naturwissenschaften，1985，72：212-213.

[11] KYTE J，DOOLITTLE R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J].J Mol Biol，1982，157（1）：105-132.

[12] JAMESON B A，WOLF H.The antigenic index：A novel algorithm for predicting antigenic determinants[J].Comput Appl Biosci，1988，4（1）：181-186.

[13] EMINI E A，HUGHES J V，PERLOW D S，et al.Induction of hepatitis a virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide[J].J Virol，1985，55（3）：836-839.

[14] 陆承平.兽医微生物学[M].第三版.北京：中国农业出版社，2001.

（责任编辑 程碧军）