绿色木霉Fn10—1纤维素酶的分离纯化及酶学特性测定

王刚等

摘要：试验研究了绿色木霉Fn10-1纤维素酶的初步纯化及酶学性质开展研究。结果表明，该纤维素酶的最适催化温度为70 ℃，最适pH 7.6，在温度为4～50 ℃下均能保持较稳定的酶活，高于50 ℃以后，热稳定性变差，酶活力开始急剧下降。pH在5.6～7.6时该酶有较好的稳定性。Na+、Mn2+、Fe2+、Mg2+、Co2+、Ca2+、Ba2+、Al3+对纤维素酶具有一定的激活作用，Ag+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、K+对该酶有一定的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用尤为明显。

关键词： 纤维素酶；绿色木霉；纯化；酶学性质

中图分类号：Q55；Q814 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3874-03

Abstract： Trichoderma viride Fn10-1 was purified with ammonium sulfate precipitation and analyzed its enzymatic characteristics. The results showed that the optimal catalysis temperature and pH of this cellulase were 70 ℃and 7.6， respectively. The enzymatic activity was stable under 4～50℃， but declined sharply above 50 ℃. It was stable when pH was 5.6～7.6. Na+，Mn2+，Fe2+，Mg2+，Co2+，Ca2+，Ba2+and Al3+ were its activator， Ag+ ，Fe3+ ，Cu2+ ，Zn2+and K+ were its inhibitors， among then Cu2+ had obvious inhibition.

Key words： cellulase； Trichoderma viride； purification； enzyme characteristic

纤维素类物质是自然界中最廉价、含量最丰富的可再生资源。但人类或大部分动物都无法直接消化纤维素，以至于大部分植物纤维素只能被烧掉或自然腐烂，仅有一小部分被人类所利用[1]。既浪费了自然资源，又造成了严重的环境污染，已有报道燃烧秸秆导致交通事故的大量案例。目前降解纤维素的主要方法有酸法、碱法、酶法、机械法及离子辐射法[2]。纤维素酶主要去除植物细胞壁中的纤维素，将纤维素水解为葡萄糖等，实现在食品工业、饲料工业、轻工业、医药工业、能源资源和钻井等方面的应用[3]。

近年来，纤维素酶在饲料加工行业得到了广泛的应用。和Walsh等[4]发现在单胃动物饲料中添加葡聚糖酶和木聚糖酶，能显著提高饲料消化率和吸收率，增加动物体重。Kung等[5]也将含高活性纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的复合酶制剂用于提高饲料的营养价值，发现可有效提高饲料利用率，Burroughs等[6]报道酶制剂对增重和产奶没有显著影响。Beauehemin等[7]将草饲料经商品纤维素酶处理，奶牛产奶量可增加5%～25%。

纤维素酶已成为饲用酶家族的一个主要组成成员，如何从源头提高纤维素酶酶活、改善酶解效率，了解掌握酶的特性，降低纤维素酶的成本是近年来研究的热点问题[8]。虽然中国是农业大国，植物资源丰富，地大物博，但是饲料资源紧张，人畜争粮的矛盾仍十分严峻。因此，本研究进行了纤维素酶酶学特性研究，为其更好地应用于饲料加工，提供一定的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

绿色木霉Fn10-1，由吉林农业大学生命科学学院提供。

1.2 培养基

PDA固体斜面培养基：葡萄糖20 g，马铃薯200 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。种子培养基：葡萄糖20 g，马铃薯200 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。液体发酵培养基：（NH4）2SO4 1.4 g，KH2PO4 2.0 g，CaCl2 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g， CMC-Na 10 g，蛋白胨 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.005 g，吐温-80 2 mL，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

1.3 方法

1.3.1 纤维素酶的粗分离

1）硫酸铵分级沉淀饱和度确定。发酵液10 000 r/min离心，取上清液调硫酸铵的饱和度分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，置4 ℃冰箱静置过夜。10 000 r/min条件下离心15 min，测上清液和沉淀中的酶活。

2）分级沉淀。取100 mL粗酶液，按上述“1）”确定的最佳硫酸铵饱和度分级沉淀酶液， 4 ℃冰箱中静止过夜，10 000 r/min离心15 min，收集沉淀，透析，备用。

1.3.2 酶最适反应温度 取酶液0.5 mL，1% CMC底物2 mL，分别于4、20、30、40、50、60、70、80 ℃进行酶催化反应，测CMC酶活。

1.3.3 热稳定性 取酶液分别置于4、20、30、40、50、60、70、80 ℃保温，每隔1 h取0.5 mL粗酶液，测CMC酶活。

1.3.4 酶最适pH 配制pH范围为3～9的磷酸盐缓冲液，在最适的温度下测酶活。

1.3.5 酶的pH稳定性 取酶液置于不同pH缓冲液中，混匀后封口过夜，测CMC酶活，以酶活最高的pH条件下所得到的测定值为100%。

1.3.6 金属离子影响 取酶液7 mL，分别加入1 mmol/L不同的金属离子，包括Na+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Ag+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、K+、Co2+、Al3+，测CMC酶活。endprint