c—Myc、k—Ras、p16在胆囊癌细胞中的表达及临床意义

卢晖+夏建兵+翁黎明+李钢++张荣+王兆平

摘 要 目的：探讨c-Myc、k-Ras、p16蛋白在胆囊癌细胞中的表达及临床意义。方法：收集20例胆囊癌、50例慢性胆囊炎和20例正常胆囊组织标本，用免疫组化法检测c-Myc、k-Ras、p16蛋白的表达，分析三种蛋白表达与胆囊癌的临床病理特征关系。结果：c-Myc、k-Ras蛋白定位于细胞质和细胞核中，在胆囊癌中的表达程度明显高于慢性胆囊炎和正常胆囊，差异有统计学意义（P<0.01）。p16定位于胞质，在胆囊癌中的表达程度明显低于正常胆囊和慢性胆囊炎，差异有统计学意义（P<0.01）。c-Myc表达程度与肿瘤大小、分化和淋巴结转移密切相关（P<0.05）；k-Ras表达程度与肿瘤大小、侵犯深度和淋巴结转移密切相关（P<0.05）。结论：c-Myc、k-Ras、p16蛋白在胆囊癌细胞中呈异常表达，其表达与临床病理特征相关，可能在胆囊癌发生发展中起有重要作用。

关键词 胆囊肿瘤 c-Myc k-Ras p16 病理特征

中图分类号：R735.8 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2014）18-0027-03

Expressions of c-Myc， k-Ras and p16 protein in gallbladder carcinoma cells and its clinical implication

LU Hui， XIA Jianbing， WENG Liming， LI Gang， ZHANG Rong， WANG Zhaoping

（Department of General Surgery of Fengcheng Hospital， the Ninth Peoples Hospital of the Medical School of Jiao Tong University， Shanghai 201411， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the expressions of c-Myc， k-Ras and p16 protein in the gallbladder carcinoma cells and their clinical implication. Methods： The expressions of c-Myc， k-Ras and p16 protein were detected in 20 cases of gallbladder carcinoma， 50 cases of chronic cholecystitis and 20 cases of normal gallbladder tissue specimens with the immunohistochemical method. The relationships of the expressions of three kinds of proteins with the clinical pathological characteristics were assayed. Results： The c-Myc and k-Ras expressions were localized in the cytoplasm and nucleus of tumor cells， and the expressions in gallbladder carcinoma were significantly higher than those in chronic cholecystitis and the normal gallbladder， whose difference had the statistical significance （P<0.01）. The location of p16 protein was found in the cytoplasm. The expression degrees in the gallbladder carcinoma were obviously lower than those in the normal gallbladder and chronic cholecystitis， whose difference had the statistic significance （P<0.01）. The expression degree of c-Myc was significant correlation with the size of the tumor， poor differentiation， and lymphatic metastasis （P<0.05）. The expression degree of k-Ras was significant correlation with the size of the tumor， depth of invasion， and lymphatic metastasis （P<0.05）. Conclusion： The expressions of c-Myc， k-Ras， and p16 protein present abnormal in the gallbladder carcinoma cells and their expressions are correlated with the clinical pathological characteristics which may probably play an important role in the occurrence and development of the gallbladder carcinoma.

KEY WORDS gallbladder carcinoma； c-Myc； k-Ras； p16； pathological characteristicsendprint

原发性胆囊癌是消化系统常见的恶性肿瘤，转移早，预后差[1-2]。近年来，研究发现多种肿瘤的发生发展与多种原癌基因如c-Myc、k-Ras的激活及抑癌基因p16失活密切相关。胆囊癌的发病因素研究也表明慢性胆囊炎与胆囊癌发生密切相关[3]。目前，c-Myc、k-Ras 与p16蛋白在胆囊癌中的表达与胆囊癌的发生发展关系尚不明确。本研究探讨c-Myc、k-Ras、p16蛋白表达与胆囊癌的临床病理特征关系，为揭示胆囊癌的发生发展机制提供理论依据。

材料与方法

临床资料

收集上海交通大学附属第九人民医院奉城分院2010年3月-2013年3月行胆囊癌根治术20例患者的胆囊癌标本，其中男8例，女12例，年龄50～82岁，平均58.6岁。同时收集慢性胆囊炎患者50例和正常胆囊者20例（复旦大学附属中山医院肝移植供肝捐赠）的胆囊标本。

研究方法

胆囊癌组织按UICC标准分级及TNM分期，采用SP法检测c-Myc、k-Ras及p16在胆囊癌、慢性胆囊炎和正常胆囊细胞中的表达。标本置4%甲醛溶液中固定12 h，脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，4 μm连续切片，操作按试剂盒说明书进行。兔抗人c-Myc、k-Ras及p16多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，工作浓度1：50。用同一指标阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

结果判定

c-Myc、k-Ras及p16蛋白表达以胞质中或胞核中出现棕黄色颗粒为显色。染色结果根据染色强度和阳性细胞面积进行半定量分析。染色强度：棕褐色为3分，棕黄色为2分，浅黄色为1分，不着色为0分。阳性细胞面积计算：阳性细胞占总面积≤10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。两项指标相加分数分为4级：0～1分“-”；2分为“+”；3～4分为“++”；5～6分为“+++”。 “-”和“+”为阴性；“++”和“+++”为阳性。设置阳性和阴性对照以保证染色结果的可靠性。

统计学处理

采用SPSS12.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

c-Myc、k-Ras 、p16蛋白表达

在胆囊癌细胞中c-Myc和k-Ras染色均一（图1c、图2c），虽然在正常胆囊和慢性胆囊炎细胞也可见染色，但颜色普遍较浅（图1a、1b， 图2a、2b）。在正常胆囊细胞中p16染色均一（图3a），在慢性胆囊炎细胞中染色较浅（图3b），而在胆囊癌细胞中则呈弱表达（图3c）。

c-Myc、k-Ras、p16表达与临床病理特征关系

c-Myc、k-Ras表达与胆囊癌患者年龄、性别、肿瘤位置无关（P>0.05），而c-Myc表达与肿瘤大小、分化和淋巴结转移密切相关（P<0.05）；k-Ras表达与肿瘤大小、侵犯深度和淋巴结转移密切相关（P<0.05，表1）。

讨论

c-Myc是myc原癌基因族中的一员，定位于人染色体8q24。c-myc癌基因转录产生的mRNA，由细胞核转入细胞质，翻译成c-Myc蛋白。细胞受生长因子刺激或c-myc癌基因被异常激活后，c-Myc蛋白的表达明显升高，引起细胞增殖，同时抑制与分化有关的基因表达，降低细胞的终末分化。Crozo等[4]发现，在乳腺癌发病中c-Myc引起的细胞周期调控异常是较晚期的分子事件，在乳腺浸润性癌组织中发现c-Myc基因扩增，而在乳腺良性和正常组织中未有发现，说明c-Myc基因过度表达可能参与了肿瘤的发生、进展过程。在本研究中，c-Myc蛋白在正常胆囊、炎症性胆囊均呈弱表达，而在胆囊癌中表达明显增高，说明在胆囊癌的演变过程中c-Myc基因可能被激活，导致细胞周期增殖失控。

k-Ras定位于染色体12p11.1-p12.1，基因产物为ras-21蛋白，具有三磷酸鸟苷酶活性，并能与GTP结合。点突变激活的ras基因所表达的rasp21蛋白的GTP酶活性降低，使p21蛋白与GTP结合时间延长，对细胞产生持续性刺激，使细胞产生持续增殖和恶性转化，在控制细胞生长和分化中起重要作用。刘海林等[5]通过MASA方法检测血浆DNA中k-Ras基因第12密码子的突变，结果在7例胆囊癌中，5例k-Ras基因突变阳性（71.4%）。k-Ras基因为原癌基因，在正常组织中可有一定表达，k-Ras基因经过突变以后，在组织中出现异常表达。Dobrzycka等[6]报道k-Ras基因阳性表达率在肿瘤组织中增加。在本研究中，k-Ras蛋白在正常胆囊和炎症性胆囊中均有表达，但在胆囊癌中表达明显上升，提示k-Ras癌基因激活是胆囊癌发生的重要因素。

p16蛋白为细胞周期素依赖性激酶（CDK）的抑制蛋白。近来研究认为，细胞周期失调是癌变的重要原因。p16蛋白能与CDK4结合，抑制CDK4/周期蛋白D复合物的催化活性，从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞增殖，在肿瘤的发生过程中起负性调节作用[7]。已发现在很多肿瘤中有p16基因的缺失和p16蛋白表达水平下降，提示p16基因的改变与很多人类恶性肿瘤的发病机制有关。本研究中p16蛋白在胆囊癌细胞的表达明显低于慢性胆囊炎和正常胆囊细胞，提示在胆囊癌发生过程中发生p16失活。

综上所述，本研究中c-Myc、k-Ras蛋白表达与胆囊癌的恶性表型TNM分期、分化程度、淋巴结转移密切相关，进一步证实c-Myc、k-Ras蛋白的过表达参与了胆囊癌的发展，提示可作为术后预测胆囊癌患者复发与转移的重要指标。

参考文献

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殷保兵 原发性胆囊癌的早期诊断[J]. 上海医药， 2014， 35（14）： 12-14.

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Crozo C， Corominas JM， Tusquets I， et al. The MYC oncogene in breast cancer progression： from benign epithelium to invasive carcinoma[J]. Cancer Genet Cytogenet， 2006， 165（2）： 151-156.

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Dobrzycka B， Terlikowski SJ， Mazurek A， et al. Circulating free DNA， p53 antibody and mutations of KRAS gene in endometrial cancer[J]. Int J Cancer， 2010， 127（3）： 612-621.

Hu B， Jarzynka MJ， Guo P， et al. Angiopoietin 2 induces glioma cell invasion by stimulating matrix metalloprotease 2 expression through the alphavbeta1 integrin and focal adhesion kinase signaling pathway[J]. Cancer Res， 2006， 66（2）： 775-783.

（收稿日期：2014-07-12）endprint