门静脉高压症小动物模型的构建及研究进展

王维杰+严佶祺+李宏为

摘 要 门静脉高压症是肝硬化最常见且致命的并发症，建立动物模型是研究门静脉高压症的理论基础。本文综述门静脉高压症小动物模型的构建方法及各种模型的特点和研究进展，以在研究中可根据不同目的选用恰当的动物模型。

关键词 门静脉高压症 肝硬化 动物模型

中图分类号：R657.3+4 文献标识码：C 文章编号：1006-1533（2014）18-0003-05

Establishment of small animal models for portal hypertension and its research progress

WANG Weijie1，2， YAN Jiqi1， LI Hongwei1

（1.Department of Surgery， Ruijin Hospital， School of Medicine， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200025， China； 2. Department of Surgery， the First Affiliated Hospital， School of Medicine， Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， China）

ABSTRACT Portal hypertension （PHT） is the most common and fatal complication of cirrhosis. Animal model is the theoretical basis in PHT research. This paper reviews the common methods used in the establishment of PHT small animal models， as well as their characteristics and research progress. The appropriate animal models can be selected according to different purposes of study.

KEY WORDS portal hypertension； liver cirrhosis； animal model

我国是慢性肝炎和肝硬化的高发地区，约有10%的人群为乙型肝炎病毒（HBV）携带者，每年因肝硬化死亡的人数高达数十万。门静脉高压症（portal hypertension， PHT）是肝硬化最常见且致命的并发症[1- 2]。构建稳定、可重复性强、操作简单和模拟性好的动物模型，是研究PHT入肝血流阻力增加、侧支循环建立与开放、内脏系统血流高动力循环等病理生理的重要手段[3- 4]。因此，本文综述研究面广、应用性强的小动物PHT模型的构建及研究进展。

肝前型PHT

部分门静脉结扎（partial portal vein ligation， PPVL）模型已广泛应用于PHT病理生理学机制的研究[5- 6]，原理是通过缩窄门静脉主干，使门静脉血液回流受阻从而导致门静脉压力升高，但肝脏组织学几乎正常[7]。通常是把1个20号钝头直针（直径0.889 mm）纵向置于大鼠门静脉主干旁，用3-0丝线将门静脉和直针结扎后抽出直针，使门静脉主干直径仅为0.889 mm，而小鼠通常选用27号钝头直针和5-0的丝线结扎，造成门静脉一定程度狭窄，从而建立PHT模型[8- 9]。

PPVL模型操作简单、廉价、重复性好、门静脉高压形成迅速且持续稳定。通常术后2 d门静脉侧支可检出分流，术后4 d肠系膜血管开始明显扩张，心输出量也显著增加[4]，术后1周，大鼠PHT已完全形成，包括显著的血流高动力循环和门静脉侧支分流[7- 8]。之后，随着侧支循环的开放，门静脉压力会有所下降，但PHT可稳定地维持至术后3周以上[5]。该模型主要适用于门静脉系统高动力循环状态和侧支循环形成机制的研究，以及前向性学说的探讨[10-11]（表1）。

肝内型PHT模型

胆总管结扎离断（common bile duct ligation， CBDL）

CBDL模型是一种继发性胆汁性肝硬化PHT [12]，原理是手术使肝外胆总管梗阻，从而引起梗阻部位以上胆管扩张、胆汁淤积及胆道内压力增高，甚至可引发肝内小胆管扩张破裂。扩张胆管及胆汁外渗压迫肝内血管，导致肝内血管系统结构的扭曲和变形，使肝细胞缺血和坏死，纤维组织增生向胆管伸展，包绕肝小叶，增加肝内阻力和门静脉血流量，最终形成肝硬化PHT[13-14]。具体方法是分离胆总管，在尽量靠近肝左、右胆管汇合处和胰管入口双道结扎胆总管，然后切除两结扎点之间胆总管，以避免胆管再通[15]。

CBDL模型门静脉压力升高显著，并可出现广泛的门体分流。由于大鼠无胆囊，因此PHT形成相对迅速且稳定。而小鼠耐受性差，往往因胆囊急剧扩大，甚至穿孔而死亡率增加[4]。大鼠在CBDL术后2周即表现轻微的门静脉高压，术后3周门静脉压力已显著而稳定地升高，肝内主要以胆管内皮细胞、肝星状细胞增殖和炎性渗出为主[16]。而术后4～6周胆汁性肝硬化PHT可稳定形成，表现为严重的高门静脉压力、血流高动力循环和30%～60%的门体分流，通常约60%的大鼠可形成腹水[4]。而相对小鼠而言，CBDL术后2～3 d为急性肝细胞损伤的高峰期，主要表现为肝内中性粒细胞大量渗出，促增殖基因上调，胆汁梗阻和血清丙氨酸转氨酶达高峰。术后5 d，肝细胞增殖修复反应出现高峰。术后2～3 d，大胆管出现胆管内皮细胞增殖，而小胆管内皮细胞增殖则出现于术后5 d。术后14 d肝内主要为淋巴细胞和Kupffer细胞浸润，表现为慢性炎症和纤维化修复反应，间质内累积合成大量胶原蛋白[17]。

CBDL模型与人类肝硬化患者在门静脉及全身血流动力学方面有较好的相似性，适合肝硬化PHT病理生理学机制的研究，也是探索药物治疗作用的有效模型[18-20]，但是存在以下缺陷：①存留的胆总管易形成胆管囊肿，压迫门静脉主干，而结扎前胆管内注射4%的甲醛溶液可解决此问题；②术后5周死亡率高达20%，但是术前预防性给予抗生素（青霉素100 mg/kg）和术后每周1次注射维生素K（50 μg）可有效降低死亡率；③不适合胆汁代谢药物的研究；④术后腹腔黏连，不利于下一步外科手术操作，胆管解剖变异导致建模失败[4]。

四氯化碳（carbon tetrachloride， CCl4）诱导肝硬化PHT模型

CCl4是肝硬化诱导最常用的化学物质，具有量效关系，其作用原理是CCl4进入机体后，经肝细胞微粒体细胞色素P450激活生成活性三氯甲基（CCl3），CCl3再通过攻击肝细胞膜的磷脂引起脂质过氧化从而破坏膜性结构，并可与蛋白质共价结合，损害线粒体导致肝内还原性辅酶A（NADH）和三磷酸腺苷（ATP）生成减少，进而抑制脂肪酸氧化和三羧酸循环，导致小叶中央肝细胞坏死。此外，由于内质网受损可导致脂蛋白合成障碍，使三酰甘油和脂肪酸在肝细胞内蓄积，形成脂肪变性。病变部位募集的巨噬细胞和各种炎性细胞清除坏死区域，并激活纤维化修复反应，增加细胞外间质合成，最终由增生的实质和间叶细胞取代坏死的肝细胞团。因此，低浓度的CCl4反复应用，可使肝组织受到损害-修复-损害的循环破坏作用，最终导致肝硬化PHT [3， 14]。

CCl4诱导的有效途径包括腹腔注射、口服灌胃和雾化吸入，通常多采用30%～60%CCl4橄榄油剂，造模时间依给药途径和剂量而不同。对于传统皮下注射法，CCl4易被机体吸收进入循环系统，对脑、肾毒性较大，注射位置易发生浸润性脓肿和溃疡，死亡率高达30%～40%，且肝硬化形成率较低，因此不推荐此方式[4]。CCl4腹腔内注射时，经门静脉系统吸收的浓度高，肝硬化形成时间短，但死亡率为20%～35%。CC14 灌胃的吸收和代谢途径类似于腹腔注射，经门静脉系统进入肝实质，但操作相对复杂，肠道反应较大。用中小剂量（1.6 g/kg）CCl4制备小鼠肝硬化时，灌胃诱导的速度优于腹腔注射，且两者生存率无差异[21]。CC14雾化吸入时，2～4周即可见显著的纤维化，5～7周后可见严重的纤维间隔形成，8～9周后即可形成肝硬化，但该法对呼吸道刺激大，动物不易耐受，中枢毒性较大，易污染环境和伤害实验人员[22]。

此外，CC14 与苯巴比妥联合诱导的方法也很常用，其机制为苯巴比妥诱导肝内混合功能氧化酶，增加细胞色素P450活性，加速CCl4向CC13转化。在CCl4给药前1周，大鼠饮用水中加入苯巴比妥（300 mg/L），12～15周后即可形成小结节性肝硬化，呈现典型PHT、30%～60%的门体分流和血流高动力循环，且多数大鼠在12～20周可形成腹水。这种方法可明显缩短建模时间，8～10周便可形成肝硬化，但由于大鼠的敏感性不同，实验中很难保证同一批模型的均质性，且死亡率可增至40%，而根据动物体重变化及耐受情况调整CCl4剂量，能有效地降低大鼠死亡率[4]。

总之，CC14模型在形态学、病理生理学的某些方面与人类肝硬化类似，两者均有肝细胞坏死后的再生，晚期的纤维浸润几乎不可逆，适于肝硬化PHT腹水和侧支循环形成机制的研究[23- 24]。

硫代乙酰胺（thioacetamide， TAA）和二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine， DMNA）诱导肝硬化PHT模型

长期低剂量应用某些致癌物如TAA和DMNA等可诱导动物肝硬化PHT和肝癌的发生[14]。TAA是一种选择性肝细胞毒素，能够稳定地诱导化学毒性肝硬化和胆管癌模型。TAA进入机体后首先由肝细胞微粒体单加氧酶、还原型辅酶Ⅱ（NADPH）及细胞色素P450作用下转化成乙酰胺及TAA-S-oxide，后者进而转化为两种不稳定的活性代谢物产物TAA-S和S-dioxide，它们通过共价结合大分子导致肝细胞变性、坏死。通常TAA首先作用于静脉周围和汇管区，短期的大剂量应用可导致肝小叶中心急性坏死。长期慢性作用可促使胆管增生和肝硬化发生，且在组织学上与病毒诱发的肝硬化很相似。反复应用TAA，激活肝内纤维化修复和炎性反应，最终诱发肝硬化PHT [3， 14]。

TAA主要以大结节性肝硬化为主，通常采取口服TAA饮用水和腹腔注射途径，且后者更稳定。通常在12周时出现PHT，典型的血流高动力循环出现在12周之后，约40%的大鼠可形成腹水，而18周后多可形成胆管癌。不同于CCl4，TAA诱导的肝硬化状态稳定，停药短期不表现自然恢复效应[3-4]。

DMNA是另一种具有肝毒性、细胞毒性和免疫毒性的化学物质，主要在肝微粒体药物氧化酶系统进行氧化代谢，活性代谢产物可导致体内核苷酸、氨基酸残基等重要的生命物质发生甲基化，从而促进肝细胞坏死，细胞外基质进行性增加，最终诱发肝纤维化和肝硬化发生。DMNA通常以腹腔注射途径给药，在连续给药5周后大鼠可出现肝纤维化和门静脉高压，但形成典型的肝硬化和腹水多需诱导13周以上[4]。

PHT模型的选择（表2）

肝内阻力不断增加和内脏血流高动力循环是肝硬化PHT形成的主要病理生理机制，而肝血窦内皮细胞功能异常和组织结构进行性紊乱是肝内阻力增加的主导因素[1]。在肝硬化PHT肝内血管紧张性增加和血管反应性失衡等机制的研究中，CCl4模型应用最多，研究证实肝血窦内皮功能紊乱导致NO产生不足和血管收缩性物质合成增加是肝内血管反应性异常的主要原因。此外，CBDL和TAA模型也可用于肝内血管反应性异常的研究，但不如CCl4模型稳定一致[4]。

内脏小动脉血管舒张是血流高动力循环演进中典型的病理生理特征，其原因是肝外NO为主的舒血管物质合成增加和内脏小血管对内源性收缩物质的高反应性[23]。PPVL、CBDL、CCl4和TAA/DMNA模型均可用于血流高动力和侧支循环形成病理机制的研究。与肝内型PHT相比，PPVL模型制备稳定、便捷，且肝外分流近100%，而前者一般不会超过60%。因此，对于PHT系统、肠系膜和侧支循环异常的研究，PPVL模型的有效性展现了更大的优势，非常适于理论假设的初步探索，而后期采用肝硬化PHT模型进一步的验证也很有必要[4]。

传统观念认为PHT肠系膜原有血管通道的再通增加了肠系膜血流循环，而新近研究表明肠系膜血管新生在内脏血流高动力和侧支循环形成中同样有着至关重要的作用，PPVL、CBDL和CCl4模型多见于此方向的研究[6， 19， 23]。此外，有关肝硬化腹水产生病理机制的研究，CCl4模型应用最多，也有少数学者采用CBDL模型[4]。

综上所述，动物模型是实验研究的基础，不同类型的PHT形成的主要病理机制大相径庭，因此，稳定地建立多种PHT动物模型，有针对性的选择适合研究方向的模型，更有利于揭示PHT演进中确切的病理机制，为其靶向治疗提供有价值的实验依据。

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（收稿日期：2014-07-05）