桑蒂复肝胶囊对D-半乳糖胺致小鼠急性肝损伤的保护作用*

1 材料

1.1 实验动物昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，体质量 (20±2)g，由第四军医大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK2002-005.046。

1.2 药物和试剂桑蒂复肝胶囊清膏，1 mL含生药2.2 g;D-GlaN(Sigma公司，临用前取1.68 g，用生理盐水溶解，再用1 mol/mL的NaOH溶液调节至7.0，然后再加生理盐水15 mL配置成10%浓度);联苯双酯滴丸 (浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号:060705);乙肝解毒胶囊 (武汉健民集团随州药业有限公司，批号:060203);SOD、MDA试剂盒 (南京建成生物研究所，批号:20060810)。

1.3 主要仪器设备低速离心机:上海安亭科学仪器厂;Nikon DXMF1200显微镜 (Nikon公司);7600-020型全自动生化分析仪 (日立公司)。

2 方法［1－2］

昆明种小鼠98只，适应性喂养3天后，分别秤重标记，随机分组为:空白对照组、模型组、桑蒂复肝胶囊高、中、低剂量组、联苯双酯组、乙肝解毒胶囊组，每组14只。桑蒂复肝胶囊高、中、低剂量组分别按照14.28、7.14、3.57 g/kg剂量灌胃;乙肝解毒胶囊组按内容物0.9 g/kg剂量灌胃给药;联苯双酯组以200 mg/kg剂量灌胃给药;空白组和模型组以纯净水灌胃。每天给药1次，连续5天，给药容积为20 mL/kg。第5天灌胃给药后1 h，按D-GlaN剂量1 g/kg给小鼠腹腔注射1次造模，小鼠禁食不禁水。24 h后，全部小鼠摘眼球取全血，以2 000 r/min速度离心10 min分离得血清，用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST水平。取肝脏，在肝左叶同一部位剪取一小块肝组织放置10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肝组织病变程度 (病变程度分别以“+++”、“++”、“+”、“-”表示，“+++”表示重度肝细胞水肿，肝细胞片状坏死，大量炎细胞浸润;“++”表示中度肝细胞水肿，肝细胞灶状坏死，或明显炎细胞浸润; “+”表示轻度肝细胞水肿，散在肝细胞点状坏死，少许炎细胞浸润;“-”表示肝组织无水肿，无坏死，无炎细胞浸润)。剩余肝脏用4℃生理盐水漂洗后放置于-80℃冰箱，测试前取肝脏，称量，加生理盐水，肝脏重量和生理盐水体积按1︰9的比例，在冰浴中制备10%肝组织匀浆，4℃3 000 r/min离心15 min，取上清液。按试剂盒操作说明测定上清液中SOD、MDA含量。

3 结果

3.1 桑蒂复肝胶囊对D-GlaN致急性肝损伤小鼠血清 ALT、AST的影响模型组小鼠血清中ALT、AST升高明显，与空白对照组比较差异有非常显著性 (P＜0.01)，说明造模成功。桑蒂复肝胶囊各剂量组ALT水平明显降低，与模型组比较，差异有显著性;桑蒂复肝胶囊高、中剂量组和联苯双酯组AST水平与模型组相比，差异有显著性(P ＜0.01或P ＜0.05)。详见表1。

3.2 桑蒂复肝胶囊对D-GlaN致急性肝损伤小鼠肝组织匀浆MDA、SOD的影响与模型对照组比较，桑蒂复肝胶囊高、中剂量组肝组织中SOD活性明显高于模型组，MDA含量明显低于模型组，差异有显著性(P＜0.01或P＜0.05)。详见表1。

表1 桑蒂复肝胶囊对血清ALT、AST及肝组织匀浆MDA、SOD的影响(±s)

注:与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别动物数 (只)剂量 (g/kg) ALT(U/L) AST(U/L) MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)空白对照组 12 - 59.4±23.8＊＊ 116.4±65.4＊＊ 1.6±0.3＊＊ 132.7±9.7＊＊＊＊模型对照组 12 - 222.4±40.0 317.5±124.8 3.8±0.6 111.0±10.7联苯双酯组 11 0.20 127.1±36.7＊＊ 246.3±58.4* 2.4±0.6＊＊ 127.6±17.7*乙肝解毒组 12 0.90 171.0±32.9* 262.4±96.1 2.7±0.5* 124.6±18.1*低剂量组 11 3.57 170.2±38.7* 263.4±80.7 2.8±0.7 123.5±10.8中剂量组 10 7.14 154.7±39.3＊＊ 225.1±84.9* 2.6±0.5* 127.3±9.2*高剂量组 10 14.28 124.2±26.8＊＊ 204.9±69.2＊＊ 2.1±0.5＊＊ 130.5±12.9

3.3 桑蒂复肝胶囊对D-GlaN致急性肝损伤小鼠肝脏组织病理学改变的影响与模型对照组比较，桑蒂复肝胶囊高、中剂量组肝组织损伤积分较低，说明高、中剂量组的保肝作用较好，而低剂量组及乙肝解毒胶囊组肝组织损伤积分较高。说明桑蒂复肝胶囊可减轻D-GlaN肝损伤动物肝细胞变性、坏死，有一定程度对抗D-GlaN所致肝细胞病理损害作用。详见表2。

表2 桑蒂复肝胶囊对肝脏组织病理学改变的影响(±s)

组别动物数(只)肝细胞水肿肝细胞坏死- + ++ +++ P值炎细胞浸润- + ++ +++- + ++ +++＜0.05模型对照组 14 7 2 3 2 8 3 2 1 7 3 2 2联苯双酯组 14 10 2 1 1 12 1 1 0 11 1 1 1 P＜0.05乙肝解毒组 14 9 2 2 1 10 1 1 2 10 2 1 1低剂量组 14 7 4 2 1 8 3 1 2 8 2 2 2中剂量组 14 10 2 1 1 10 2 2 0 11 2 1 0 P＜0.05高剂量组 14 11 1 1 1 12 1 1 0 12 1 1 0 P＜0.05空白对照组 14 9 3 2 0 14 0 0 0 14 0 0 0 P

4 讨论

D-GlaN复制的肝损伤可模拟病毒性肝损伤，其表现出来的症状，肝功能检测指标，肝脏病理改变与病毒性肝炎具有相似性，是目前公认的比较好的研究病毒性肝炎的发病机制及有效治疗药物的实验动物模型。［3］D-GlaN是肝细胞的磷酸尿嘧啶核苷的干扰剂，进入体内后与磷酸尿苷结合形成磷酸尿苷-半乳糖胺，致使磷酸尿苷耗竭，导致核酸、糖、蛋白、脂类等物质合成受抑致，限制了细胞器及酶的生成和补充，细胞器受损、膜损害，钙离子内流入细胞，从而造成肝细胞损伤，肌体对内毒素吸收增加、自由基的产生和脂质过氧化反应等也是D-GlaN致肝损伤的重要因素。［4］肝细胞内所含的酶是血清酶类的主要来源，整个肝内转氨酶的量约为血清中的100倍，ALT主要存在于肝细胞的可溶部分，AST则存在于肝细胞的线粒体中，故血清中ALT和AST水平可敏感反映肝细胞膜的损伤状况。［5］MDA为脂质过氧化的最终产物，可以破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀坏死，SOD是清除氧自由基的重要酶，具有清除超氧阴离子自由基，防止自由基对细胞结构的损伤，二者联合检测可以反应肌体细胞受自由基攻击的严重程度。本文结果表明，桑蒂复肝胶囊对D-GlaN所致小鼠急性肝损伤有明显的保护作用，可以降低小鼠血清AST、ALT水平，提高肝组织匀浆SOD活力，降低MDA含量，减轻小鼠肝损伤组织的病理程度，其机制可能与其保肝降酶、清除自由基等有关。

［1］徐书云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.北京:人民卫生出版社，1985.934-945

［2］刘耕陶.中药药理研究与新药创新［M］.北京:中国协和医科大学出版社，2001.1 226

［3］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社，1993.980

［4］王四旺，施新酋，黄传贵，等.中药药效学研究与评价［M］.西安:陕西科学技术出版社，2005.351

［5］陈紫榕.病毒性肝炎［M］.北京:人民卫生出版社，2002.226