高效液相色谱法测定土霉素片的含量

张亚茹，何玉川，张 英

0 引言

土霉素片原标准WS1-C2-0002-89中的含量测定采用抗生素微生物检定法的管碟法。因其方法操作繁琐，影响因素诸多，检验时间较长，尤其不利于生产企业中间产品的质量控制，为了更有效地控制该药品质量，本文采用了高效液相色谱法测定土霉素片的含量，方法准确、快速、简便，重复性好。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪日立L-2000;电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);紫外可见分光光度计 TU-1901(北京普析通用仪器有限责任公司);酸度计 FE20K(梅特勒托利多仪器有限公司);土霉素标准品874 U/mg(中国药品生物制品检定所，批号:0305-200720);土霉素片:吉林市鹿王制药股份有限公司、赤峰蒙欣药业有限公司、天津天士力(辽宁)制药有限公司。色谱纯乙腈，自制超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:Diamonsil C18(2)5 μm 250×4.6 mm 色谱柱;柱温:30℃;流动相:0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液-乙腈=81∶19(用磷酸调pH为2.0);流速0.8 mL/min;检测波长:353 nm;进样量:20.0 μL;土霉素峰与相邻杂质峰的分离度大于2.0。

2.2 供试品溶液与对照品溶液的制备 取土霉素片10片，精密称定，研细，称取适量用盐酸溶液(0.1 mol/L)溶解、过滤，制成20 μg/mL的溶液，作为供试品溶液。另精密称取土霉素标准品适量同法制成20 μg/mL的对照品溶液。

2.3 空白干扰试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、稀释剂各20.0 μL分别注入高效液相色谱仪，在供试品溶液的液相色谱图中，在与对照品溶液色谱相应的位置上有相应的色谱峰，而稀释剂色谱图中在此位置并无色谱峰，证明本方法可行，稀释剂无干扰。见图1。

3 结果

图1 HPLC色谱图

3.1 线性关系考察 精密称取土霉素标准品适量至50 mL量瓶中，加盐酸溶液(0.1 mol/L)溶解并稀释至刻度，得到标准品储备液0.05 mg/mL。分别精密量取上述标准品储备液 1、2、3、4、5、6 mL至10 mL量瓶中，加盐酸溶液(0.1 mol/L)稀释至刻度，分别吸取上述各标准品溶液20.0 μL注入高效液相色谱仪中，测定峰面积(753940、1494132、2276211、3073063、3816665、4612532)，以土霉素标准品的浓度为X轴，液相峰的峰面积为Y轴绘制线性关系图，并计算线性关系方程。回归方程为 y=154 614x-34 651，相关系数 r=0.999 9，说明土霉素标准品的浓度在 5～30 μg/mL范围内线性关系良好。

3.2 稳定性试验(10 h) 精密吸取供试品溶液，分别在 0，2，4，6，8 h 进样测定，结果供试品峰面积的RSD%为0.9%(n=5)，说明样品溶液在10 h内的稳定性良很好。

3.3 精密度试验 精密吸取2.2项下的标准品溶液20.0 μL，依法连续进样6次并测定。结果土霉素标准品主成分的色谱峰面积的RSD%为0.5%(n=6)，表明本方法的精密度很好。

3.4 重复性试验 称取同一供试品，按2.2项下方法制备供试品溶液6份依法测定其含量，结果平均值为98.8%，RSD%为0.3%，表明本方法重复性良好。

3.5 加样回收率试验精密称取已知含量(含量98.8%，平均片重0.459 6 g)的供试品粉末9份，每份约7.5 mg，分成3组，每组3份，分别置9个100 mL的容量瓶中，第1组、第2组、第3组每瓶精密加入土霉素标准品溶液(100 μg/mL)分别为5、10、15 mL，再加入盐酸溶液(0.1 mol/L)稀释至刻度，制成供试品溶液，依法测定，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

3.6 样品含量测定 按2.2方法操作，以外标法计算土霉素的含量。结果3批样品中130911、130315、20130501含土霉素分别为标示量的98.8% ，97.4% ，96.5% 。

4 讨论

4.1 检测波长的确定 现在用高效液相色谱法测定土霉素片含量的文献很多，参考文献中检测波长也各不相同，如有 267、268、254、280、353、355、350 nm等，比较混乱，本文选取在测定土霉素时的最佳检测波长做了下述实验。

取土霉素标准品，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.02 mg的溶液，照紫外-可见分光光度法在200～400 nm波长处进行扫描，结果在268.5 nm和353.1 nm波长处均有最大吸收，但在268.5 nm左右处有稀释剂杂质峰的影响，而高效液相色谱法所用的也是紫外检测器，故选取353 nm为最佳检测波长。

4.2 用于流动相中试剂种类的选择及pH选择文献中用于高效液相色谱法测定土霉素的流动相试剂种类也很多，如草酸铵、N，N-二甲基甲酰胺、磷酸氢二铵、磷酸二氢钠、枸橼酸等，本研究本着简单易得既保证检验质量，又降低实验成本的原则，选择了本文中用于流动相的试剂种类。

对所用流动相分别考察了pH4.8(未进行pH值的调节时)、pH 4.0、pH 3.0和 pH为2.0时标准品的分离度，只有pH为2.0时分离度达到要求，故选用0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液-乙腈=81∶19(用磷酸调pH为2.0)为本方法的流动相。

综上所述，采用高效液相色谱法测定土霉素片中土霉素的含量具有简便、快捷、经济、准确、重现性好等优点，该法可用于土霉素片的质量控制。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010(二部)［M］.北京:中国医药科技出版社.

［2］刘东育，李岩高.效液相色谱法测定土霉素片的含量［J］.中国药业，2011，24:36-37.

［3］高广慧，李阳，孙晓娟，等.HPLC法测定牛羊肉中土霉素、四环素、金霉素残留量［J］.食品研究与开发，2013(16):94-96.

［4］赵晶晶，王玮，宋扬.高效液相色谱法测定中药散剂中添加的土霉素［J］.中国兽药杂志，2013，47(1):36-38.