格尔德霉素对SMYD3核转位的影响

齐燕南，邢莹莹，奚 涛

（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京210009）

在基因组中，除了核酸序列本身，还有许多信息可以调控基因表达并且可以遗传给子代，这就是表观遗传学[1］。表观遗传学主要包括DNA甲基化和组蛋白修饰。其中，组蛋白修饰在转录调控中发挥着重要的作用。组蛋白修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、核糖基化、瓜氨酸化、泛素化等6种形式[2］。

SMYD3是一种新发现的组蛋白甲基化酶，它包含SET和MYND两个结构域，通过与启动子区域的“5′－CCCTCC－3′”序列结合可以上调下游基因（包括很多原癌基因[3］）的表达，在肿瘤发生中有着重要的作用，但SMYD3需要进入细胞核才能发挥其组蛋白甲基化酶的作用。SMYD3的过表达可以促进多种癌细胞的增殖[4－5］，而用 RNAi敲除SMYD3则可以明显抑制癌细胞的增殖[6］。罗学刚等[7］研究表明，SMYD3过表达可以促进人乳腺癌细胞的增殖，而抑制组蛋白修饰将促进癌细胞的凋亡[8］，说明抑制SMYD3通路有望成为肿瘤治疗的新方法。

格尔德霉素（geldanamycin）是一种HSP90特异性的抑制剂。研究表明，HSP90可以与SMYD3形成复合体促进SMYD3在转录水平的调控[4］。

作者在此研究了格尔德霉素对SMYD3核转位的影响，并探讨了SMYD3核转位受到抑制时对细胞增殖的影响。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

人乳腺癌细胞株MDA－MB－231，中国药科大学肿瘤药理实验室。

1640、胎牛血清，Gibco公司；胰酶；PBS；二甲基亚砜（DMSO）；MTT；核蛋白提取试剂盒，南京凯基；SMYD3多克隆抗体，自制；β－actin多克隆抗体，Santa Cruz公司；脱脂奶粉；蛋白印记发光液，Pierce公司；显影液；定影液；格尔德霉素，上海生工。

RPMI 1640培养基：含10%的胎牛血清、100μg·mL－1的链霉素和100U·mL－1的青霉素。

细胞培养箱，ThermoForma公司；酶标仪，BioRad公司；倒置显微镜，Leica公司；6孔板、96孔板，Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 Western blot法检测SMYD3核转位

将 MDA－MB－231细胞（在 RPMI 1640培养基中于5%CO2、37℃培养箱中培养）接种于6孔板中培养至70%融合。将格尔德霉素溶于DMSO，加至6孔板中，使每孔的格尔德霉素终浓度（μmol·L－1）分别为0.03、0.06、0.12、0.24、0.48，继续培养24h。将细胞用胰酶消化，离心，PBS洗2遍，按照核蛋白提取试剂盒说明提取核蛋白和胞质蛋白。蛋白浓度用BCA法测定。

取蛋白样品50μg进行电泳（SDS－PAGE）：分离胶为10%，浓缩胶为5%，起始电压为80V，电泳至分离胶时调为120V，继续电泳2h。电泳完成后半干式转移到NC膜上。一抗4℃过夜孵育，二抗室温1h孵育，用ECL发光液暗室显色，考察格尔德霉素对SMYD3核转位的影响。

1.2.2 MTT比色法检测 MDA－MB－231细胞的增殖

将MDA－MB－231细胞以每孔5×103个接种于96孔板，培养至70%融合，加入不同浓度（0.03、0.06、0.12、0.24、0.48，μmol·L－1）格尔德霉素继续培养24h，向待测每孔加入20μL浓度为5mg·mL－1的MTT，37℃继续孵育4h，加入150μL的DMSO，用酶标仪在波长570nm处测定吸光度（吸光度与细胞存活数成正比），考察格尔德霉素对 MDA－MB－231细胞增殖的影响。

2 结果与讨论

2.1 格尔德霉素对SMYD3核转位的影响

经过24h不同浓度格尔德霉素处理后，提取MDA－MB－231细胞的核蛋白和胞质蛋白，采用 Western blot法检测SMYD3的入核情况，结果见图1。

由图1可见，随着格尔德霉素浓度的增大，入核的SMYD3逐渐减少，说明格尔德霉素能浓度依赖性地抑制SMYD3的入核。

2.2 格尔德霉素对MDA－MB－231细胞增殖的影响（图2）

由图2可知，格尔德霉素具有较好的抗肿瘤能力，浓度为0.03mol·L－1时就对 MDA－MB－231细胞增殖有明显的抑制作用。表明格尔德霉素可以通过抑制SMYD3的核转位抑制MDA－MB－231细胞的增殖。

图2 格尔德霉素对MDA－MB－231细胞增殖的影响Fig.2 Effect of geldanamycin on the proliferation of cancer cells MDA－MB－231

3 结论

采用Western blot检测法研究了不同浓度的格尔德霉素对人乳腺癌细胞 MDA－MB－231中SET 和MYND结构域蛋白3（SMYD3）核转位的影响，采用MTT比色法检测了格尔德霉素对人乳腺癌细胞MDA－MB－231增殖的影响。结果表明：格尔德霉素可以抑制SMYD3的核转位，并且这种抑制作用是浓度依赖性的；与对照组相比，人乳腺癌细胞 MDA－MB－231的增殖速率被显著地抑制了。说明格尔德霉素可以通过抑制SMYD3的核转位显著抑制人乳腺癌细胞MDA－MB－231的增殖。

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