辐射对体外培养MC3T3-E1成骨前体细胞增殖和分化的影响

李玉梅 赵铱民 查年保 舒震 张松

1.襄阳市中心医院口腔科，襄阳 441021；2.第四军医大学口腔医院修复科；

3.第四军医大学药学系生物技术中心，西安 710032；4.第四军医大学唐都医院药剂科，西安 710038

高剂量的放射治疗会对正常的骨组织产生不良作用，如骨质疏松、放射性骨坏死、颅面部骨生长迟缓等。1983年，Marx[1]提出了被广泛接受的骨坏死病理机制：即射线引起动脉内膜炎，接着发生组织缺氧、细胞数减少以及血管减少，最终出现慢性不愈合的伤口。其后学者们的研究更加关注于骨细胞，并认为骨细胞的改变要先于血管，而骨重建的抑制是发生骨坏死的关键所在[2]。本文拟从MC3T3-E1成骨前体细胞入手，探讨60Co γ射线对成骨细胞增殖和分化的影响，为辐射骨损伤的防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器设备

α-MEM培养基（HyClone公司，美国），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），β-磷酸甘油、抗坏血酸（西安沃尔森生物技术有限公司），3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻蓝 [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte-trazolium bromide，MTT]（西安科昊生物工程有限责任公司）；黏胶纤维红（Sigma公司，美国），茜素红（西安舟鼎国生物技术有限公司）；实时荧光定量聚合酶链反应（real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）相关试剂（TaKaRa公司，日本）；酶标仪（BIO-TEK公司，美国）；60Co源（第四军医大学钴源室）；7500型qPCR仪（ABI公司，美国），基因扩增仪（东胜创新生物科技有限公司）。

1.2 细胞培养及成骨诱导

采用MC3T3-E1成骨前体细胞系亚克隆14（上海中科院细胞库）进行实验。使用含10%新生牛血清、100 IU·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的α-MEM培养基，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，常规换液与传代。用成骨诱导培养基诱导细胞成骨。成骨诱导培养基：在上述培养基里添加5 mmol·L-1的β-磷酸甘油和50 μg·mL-1抗坏血酸。

1.3 细胞辐射

MC3T3-E1细胞接种24 h后进行60Co γ射线照射。单次照射剂量分别为4、8 Gy，换液后继续培养观察。对照组带入准备室，但不接受照射。

1.4 细胞增殖实验

细胞以每孔1.5×103个的密度接种于96孔板，培养24 h后分别接受4、8 Gy射线照射。照射后1、3、5、7 d终止培养，PBS漂洗1次，每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1）和200 μL无血清α-MEM培养基。37 ℃孵育4 h后吸弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶解生成的结晶物，室温下振荡20 min，然后置于分光光度仪上于490 nm处测量其光密度（optical density，OD）值。

1.5 细胞胶原分泌的测定

使用黏胶纤维红染色法测定胶原分泌[3]。细胞以每孔7.5×104个的密度接种于6孔板，培养24 h后接受4、8 Gy射线照射。细胞接近融合后更换为成骨诱导培养基。辐射后第12天终止细胞培养，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3遍。0.1%黏胶纤维红（溶于饱和苦味酸）染色18 h，盐酸漂洗，细胞照相。定量分析时，加入氢氧化钠溶解染色，570 nm处测量OD值。

1.6 成骨相关基因mRNA表达的测定

采用qPCR法检测4种成骨相关基因mRNA的表达，分别为Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、转录因子Osterix（OSX）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和骨钙素（osteocalcin，OCN）。细胞以每孔7.5×104个的密度接种于6孔培养板，培养24 h后分别接受4、8 Gy射线照射。细胞接近融合后更换为成骨诱导培养基。辐射后第16天终止细胞培养，PBS漂洗后用适量Trizol裂解细胞，按试剂盒描述的步骤提取总RNA并定量。取1.0 μg总RNA，按照Prime Script RT reagent Kit说明进行逆转录，条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。配制qPCR反应液，所使用的引物见表1，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参，置于7500型qPCR仪内进行反应。采用2-ΔΔCt法对数据进行相对定量分析，0 Gy组数据作为校正样本。

表1 qPCR所使用的引物Tab 1 Primers used for qPCR

1.7 细胞基质矿化测定

使用茜素红染色测定细胞基质矿化情况。细胞以每孔5×104个的密度接种于6孔板，培养24 h后接受4、8 Gy射线照射。细胞接近融合后更换为成骨诱导培养基。辐射后第28天终止细胞培养，PBS漂洗2次，75%乙醇固定1 h。40 mmol·L-1茜素红染液（pH=4.2）室温染色20 min，PBS漂洗5次后10%氯化十六烷基吡啶溶解染色，置于分光光度仪上于570 nm处测OD值。

1.8 统计学分析

使用SPSS 16.0统计分析软件，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较各组均数之间有无差异，Tukey显著差异法进行均数之间的两两比较，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 细胞增殖实验

细胞增殖实验结果见表2。与未辐射组相比，从辐射后第3天开始，4、8 Gy的辐射剂量均导致MC3T3-E1细胞的增殖明显降低（P＜0.05），并且这种降低呈现剂量依赖性。

2.2 细胞胶原分泌

经不同剂量的辐射后，MC3T3-E1细胞胶原分泌的染色情况见图1：随辐射剂量的增加，染色强度逐渐降低。对照组（0 Gy）、4 Gy和8 Gy组胶原定量分析的OD值分别为1.368±0.208、1.059±0.169和0.856±0.078，3组间的差异有统计学意义（F=7.738，P=0.022），8 Gy组明显低于对照组。

表2 经不同剂量辐射后细胞MTT实验的OD值Tab 2 The OD value of cells in MTT assay under different radiation doses

图1 经不同剂量辐射后细胞的胶原分泌 黏胶纤维红染色 × 6.3Fig 1 Collagen secretion by cells under different radiation doses sirius red staining × 6.3

2.3 成骨相关基因mRNA的表达

4种成骨相关基因的表达见表3：4 Gy以上射线可以明显抑制MC3T3-E1细胞OSX和OCN基因的表达（P＜0.05），但对RUNX2基因无明显影响（P＞0.05）；8 Gy射线可轻微下调细胞OPN基因的表达，但与对照组相比差异并无统计学意义（P＞0.05）。

表3 经不同剂量辐射后细胞成骨相关基因的表达Tab 3 Expression of osteogenesis-related genes of cells under different radiation doses

2.4 细胞基质矿化

对照组（0 Gy）、4 Gy和8 Gy组细胞基质矿化定量分析的OD值分别为2.155±0.257、1.728±0.265、1.485±0.042，3组差异有统计学意义（F=7.497，P=0.023），随着射线剂量增大细胞基质矿化降低，8 Gy照射组与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

MC3T3-E1成骨前体细胞系来源于新生小鼠颅顶骨，在体外可以分化为骨细胞，是较常用的研究射线对成骨细胞影响的细胞系之一[4]。检测射线对细胞增殖影响的主要方法有克隆形成实验、MTT法、细胞计数以及DNA含量测定等。MTT实验是测试射线对细胞活性影响可靠、方便的方法之一。通过MTT实验，本研究发现，从辐射后第3天开始，4 Gy以上的辐射剂量显著降低了MC3T3-E1细胞的增殖，与以往文献[4-6]报道一致。

骨的有机成分主要是Ⅰ型胶原，而黏胶纤维红染色能特异性检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原，并能够在原位确定产生胶原的细胞[3]。本研究显示，8 Gy射线显著抑制了MC3T3-E1细胞胶原分泌，与Gal等[6]的研究结果类似。本研究采用茜素红染色及定量分析对MC3T3-E1细胞基质矿化能力进行检测，结果表明，8 Gy射线导致细胞矿化能力显著降低。Gevorgyan等[7]研究证明，15 Gy射线可引起兔眶颧复合体骨膜来源成骨细胞矿化能力明显下降。

本研究进一步探讨了射线对于MC3T3-E1细胞成骨相关基因表达的影响。RUNX2是与果蝇蛋白Runt同源的成骨相关转录因子，可与成骨特异顺式作用元件结合，调节OCN、Ⅰ型胶原α1链（collagen type Ⅰα1-chain，Col-Ⅰα1）和OPN基因的表达。本研究表明，在辐射后第16天，8 Gy射线并没有引起RUNX2基因mRNA水平的改变；Schönmeyr等[8]的研究也得出相似的结论。OSX是另一个重要的成骨相关转录因子，位于RUNX2的下游。在多能间充质干细胞向前成骨细胞分化过程中，RUNX2起了重要作用，而在其后的调控前成骨细胞向成熟成骨细胞分化的过程中，RUNX2的表达下调，OSX则成为主要的作用基因[9]。本研究发现，4 Gy以上射线显著抑制了细胞OSX基因的表达，由此推测，射线有可能在成骨过程的中晚期通过下调OSX基因的表达来抑制细胞的分化能力。OPN是一种酸性糖蛋白，在成骨细胞增殖期有低表达，随后下降；在细胞矿化起始期（第16～20天）第2次表达并达到峰值。OCN在矿化结节形成时才开始表达，是成骨细胞成熟的标志[10]。本研究显示，射线可抑制OCN基因的表达，随着射线剂量的增加，抑制作用增强，与其他文献[5,11]报道一致。对于OPN基因，射线并无明显下调作用。Matsumura等[11]发现，MC3T3-E1细胞接受10 Gy射线照射后，辐射后第16天OPN的表达与未照射组相比无明显改变。

本研究从细胞和分子层面揭示了辐射骨损伤发生的可能机制，证实60Co γ射线可以降低MC3T3-El成骨前体细胞的增殖、胶原分泌及基质矿化能力，并可下调其成骨相关基因的表达。

[1]Marx RE. A new concept in the treatment of osteoradionecrosis[J]. J Oral Maxillofac Surg, 1983, 41(6):351-357.

[2]Al-Nawas B, Duschner H, Grötz KA. Early cellular alterations in bone after radiation therapy and its relation to osteoradionecrosis[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2004, 62(8):1045.

[3]Tullberg-Reinert H, Jundt G. In situ measurement of collagen synthesis by human bone cells with a sirius red-based colorimetric microassay: effects of transforming growth factor beta2 and ascorbic acid 2-phosphate[J]. Histochem Cell Biol,1999, 112(4):271-276.

[4]Dare A, Hachisu R, Yamaguchi A, et al. Effects of ionizing radiation on proliferation and differentiation of osteoblastlike cells[J]. J Dent Res, 1997, 76(2):658-664.

[5]Gevorgyan A, Sukhu B, Alman BA, et al. Radiation effects and radioprotection in MC3T3-E1 mouse calvarial osteoblastic cells[J]. Plast Reconstr Surg, 2008, 122(4):1025-1035.

[6]Gal TJ, Munoz-Antonia T, Muro-Cacho CA, et al. Radiation effects on osteoblasts in vitro: a potential role in osteoradionecrosis[J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 2000, 126(9):1124-1128.

[7]Gevorgyan AM, La Scala GC, Sukhu B, et al. Radiationinduced craniofacial bone growth inhibition: in vitro cytoprotection in the rabbit orbitozygomatic complex periosteumderived cell culture[J]. Plast Reconstr Surg, 2008, 121(3):763-771.

[8]Schönmeyr BH, Wong AK, Soares M, et al. Ionizing radiation of mesenchymal stem cells results in diminution of the precursor pool and limits potential for multilineage differentiation[J]. Plast Reconstr Surg, 2008, 122(1):64-76.

[9]Zhang C. Transcriptional regulation of bone formation by the osteoblast-speci fi c transcription factor Osx[J]. J Orthop Surg Res, 2010, 5:37.

[10]Lian JB, Stein GS. Concepts of osteoblast growth and differentiation: basis for modulation of bone cell development and tissue formation[J]. Crit Rev Oral Biol Med, 1992, 3(3):269-305.

[11]Matsumura S, Hiranuma H, Deguchi A, et al. Changes in phenotypic expression of osteoblasts after X irradiation[J].Radiat Res, 1998, 149(5):463-471.