罗丹明汞离子荧光探针的合成及光谱研究

张丽珠，于 璐，梁 坤，谷利军，樊保敏，杨丽娟

（1. 云南民族大学 国家民委-教育部民族药资源重点实验室，云南 昆明 650500；2. 西南林业大学 理学院，云南 昆明 650224）

罗丹明汞离子荧光探针的合成及光谱研究

张丽珠1，于 璐1，梁 坤2，谷利军1，樊保敏1，杨丽娟1

（1. 云南民族大学 国家民委-教育部民族药资源重点实验室，云南 昆明 650500；2. 西南林业大学 理学院，云南 昆明 650224）

通过硫的亲汞性和氨基硫脲衍生物能被Hg2+转化为胍衍生物的机理，合成了一种新的Hg2+探针3′，6′-二乙氨基-2，7-二甲基-2-（N-氨基乙基）螺［异吲哚-1，9′-呫吨］-3-硫酮（R6G1）。考察了探针R6G1的水溶性、光谱性能及其在水相中对常见离子的选择性，测定了探针R6G1与Hg2+的络合比例和络合常数。水溶液中金属阳离子选择性测试结果表明，探针R6G1的水溶性好，能高选择性地识别Hg2+，该识别过程不受Fe3+，Cu2+，Al3+，Cr3+，Fe2+，Mn2+，Co2+，Pb2+，Mg2+，Ca2+，Cd2+，Zn2+，Ba2+等金属阳离子和F-，Cl-，Br-等阴离子的干扰。紫外滴定结果表明，探针R6G1与Hg2+按1∶1的化学计量比络合。荧光滴定测试结果表明，探针R6G1识别Hg2+的络合常数lgKa=5.92。

罗丹明；荧光探针；汞离子；光谱性能

汞是一种危害人体健康的重金属元素［1］，通常环境中的汞主要来自于火山喷发和地质风化，然而随着工业化的不断发展，环境中汞的排放则主要来自于人类活动。汞在自然界中主要以单质汞、无机汞和有机汞3种形式存在，通过生物的富集作用，进到食物链中，人体吸收过量的Hg2+后会导致中枢神经系统、肝、肾和肠道的损害，严重时甚至会引起死亡［2-3］。因此，生物体和环境中Hg2+的检测十分重要。近年来，检测Hg2+的方法主要有原子吸收-发射光谱法、分光光度法、高效液相色谱法、电化学法和荧光分析法等［4-7］。其中，荧光分析法因具有便捷、专一、灵敏和适时原位检测等优点而备受关注。虽然目前有关检测Hg2+的荧光探针报道［8-12］较多，且大多数Hg2+探针都能做到单一地高选择性和高灵敏度识别，但由于受到一些重要因素（如探针配体水溶性差等）的限制，目前有关能在水相中检测Hg2+且不受溶液中阳离子和阴离子干扰的探针的报道还较少［9，13］。

本工作合成了一种新的Hg2+探针3′，6′-二乙氨基-2，7-二甲基-2-（N-氨基乙基）螺［异吲哚-1，9′-呫吨］-3-硫酮（R6G1）；考察了探针R6G1的水溶性、光谱性能及其在水相中对常见离子的选择性；测定了探针R6G1与Hg2+的络合比例及络合常数。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

400 MHz型核磁共振仪：Brucker公司；Saturn 2200/2100型液相色谱-质谱联用仪和Cary Eclipse型荧光分光光度计：Varian公司；8453型紫外-可见分光光度计：Agilen公司。

罗丹明6G、劳森试剂、甲苯、甲醇、二氯甲烷、水合肼：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 探针R6G1的合成

以罗丹明6G为原料，利用硫的亲汞性和氨基硫脲衍生物能被Hg2+转化为胍衍生物的原理，合成了R6G1，合成路线见式（1）。其中，3′，6′-二乙氨基-2，7-二甲基-2-（N-氨基乙基）螺［异吲哚-1，9′-呫吨］-3-酮（化合物Ⅰ）按文献［15］报道的方法合成。将5.5 g化合物Ⅰ和2.5 g劳森试剂加入到圆底烧瓶中，N2保护下加入35 mL甲苯，缓慢升温至回流，6 h后停止加热，冷却至室温。蒸出甲苯，粗产物用体积比为100∶3的二氯甲烷和甲醇的混合溶液（作为洗脱液）进行柱层析，得到白色固体（即R6G1）1.53 g，收率为26%。

Compound Ⅰ：3′，6′-diethylamino-2，7-dimethyl-2-(N-aminoethyl)spiro［isoindoline-1，9′- xanthene］-3-ketone；R6G1：3′，6′-diethylamino-2，7-dimethyl-2-(N-aminoethyl)spiro［isoindoline-1，9′-xanthene］-3-thione.

1.3 光谱实验

经实验发现，探针R6G1具有良好的水溶性，这为探针R6G1在水体系中的应用提供了可能。因此，探针R6G1的荧光光谱和紫外吸收光谱均在三羟甲基氨基甲烷（Tris）-HCl（pH=7）的缓冲溶液中测试。溶液中探针R6G1的浓度为5 μmol/L，加入的各离子的浓度为200 μmol/L。激发波长为510 nm，激发狭缝为2.5 nm，发射狭缝为5 nm。

2 结果与讨论

2.1 离子的选择性和光谱性能测试

探针R6G1是按照硫的亲汞性设计合成的，因此在浓度为5 μmol/L的R6G1溶液中加入浓度为200 μmol/L的Hg2+，Fe3+，Cu2+，Al3+，Cr3+，Fe2+，Mn2+，Co2+，Pb2+，Mg2+，Ca2+，Cd2+，Zn2+，Ba2+，K+，Ni2+，以考察探针R6G1的离子选择性，实验结果见图1。由图1可见，加入Hg2+后R6G1的荧光强度显著增强，加入Fe3+和Cu2+后R6G1的荧光强度略有增强，而加入其他金属离子对R6G1的荧光强度几乎无影响。这与本工作的设计理念吻合。

水相中Hg2+浓度变化与探针R6G1相互作用的荧光滴定曲线见图2。由图2可见，未加入Hg2+时，R6G1的荧光强度几乎为零，表明此时探针R6G1为闭环状态。加入Hg2+后，在566 nm处出现一个新的荧光特征峰，且荧光强度随Hg2+浓度的增大而增强，表明R6G1内酰胺结构的打开产生了荧光，且荧光强度的增幅与Hg2+浓度呈线性关系，溶液颜色也由无色逐渐变成粉红色。

图1 探针R6G1的离子选择性Fig.1 Ion selectivity of the probe R6G1.

图2 水相中Hg2+浓度变化与探针R6G1相互作用的荧光滴定曲线Fig.2 Fluorometric titration curves of the interaction between the probe R6G1 and Hg2+ concentration change in aqueous solution.

为考察探针R6G1与Hg2+的络合比例和检测灵敏度，测试了探针R6G1与Hg2+结合的紫外吸收光谱的Job-Plot曲线（见图3）和络合常数（Ka）。由图3可见，R6G1与Hg2+是按1∶1的化学计量比络合的。基于此络合比例，计算得到lgKa=5.92，表明探针R6G1具有较高的灵敏度。

为考察其他金属阳离子和阴离子对探针R6G1鉴别Hg2+的影响，还进行了其他金属阳离子和阴离子的干扰实验，实验结果见图4。

图3 R6G1与Hg2+结合的紫外吸收光谱的Job-Plot曲线Fig.3 Job-Plot curves of the ultraviolet absorption spectrum of R6G1 and Hg2+.

图4 金属阳离子和阴离子对Hg2+识别的干扰Fig.4 Competition experiments of Hg2+ with other metallic ions and anions.

由图4（a）可见，在浓度为5 μmol/L的R6G1溶液中加入浓度为200 μmol/L的其他金属阳离子后，荧光强度几乎没有变化，之后再加入Hg2+，荧光强度显著增强；除Cu2+，Al3+，Cr3+，Fe3+外，加入其他金属阳离子后R6G1的荧光强度的增幅与单独加入Hg2+后R6G1的荧光强度的增幅相同，表明其他金属阳离子的存在未干扰R6G1对Hg2+的检测。而Cu2+，Al3+，Cr3+，Fe3+的加入使得R6G1的荧光强度显著增强则可能是因为高浓度下，这4种金属阳离子发生水解使缓冲能力有限的Tris-HCl溶液的pH略有降低，较低的pH使得R6G1的酰胺结构部分开环，从而导致荧光强度增强。

由图4（b）可见，添加阴离子后，除I-的加入使荧光强度下降外，其他阴离子对荧光强度的影响不大，而I-的加入使荧光强度下降可能是由于I-与Hg2+形成了［HgI4］2+，从而使Hg2+无法正常与R6G1结合所致，这与文献［12］报道的结果基本一致。

2.2 体系pH对探针R6G1的影响

考察体系pH对探针R6G1和R6G1识别Hg2+后荧光强度的影响，实验结果见图5。由图5可见，探针R6G1在较宽的pH范围（3.5～12.0）内主要以螺环形式存在，其水溶液既无颜色又无荧光，通过Sigmoidal拟合计算得pKa=2.52±0.07，表明探针R6G1是一种对pH不敏感的荧光分子。由图5还可见，当R6G1识别Hg2+后，尽管荧光强度变化较大，但并不影响探针在酸性和中性环境中对Hg2+的识别，该测试结果为探针R6G1在实际环境中的应用创造了很好的条件。

图5 R6G1和R6G1+Hg2+的pH滴定结果Fig.5 pH titrations of the R6G1 system and the R6G1+ Hg2+ system.

2.3 反应机理的探讨

为进一步研究探针R6G1与Hg2+的络合机理，根据文献［14］报道的氨基硫脲衍生物能被Hg2+转化为胍衍生物的机理，可以推测出R6G1与Hg2+进行络合反应的可能机理（见图6），即随Hg2+的加入，Hg2+与S结合生成HgS沉淀，从而得到3′，6′-二乙氨基-2，7-二甲基-2-（N-苯基）-［6H-呫吨］咪唑（R6G3），并对R6G3进行了MS表征，从表征结果可确定所得产物为R6G3。

图6 R6G1与Hg2+进行络合反应的可能机理Fig.6 Proposed mechanism for the complexing reaction of R6G1 with Hg2+.

3 结论

1）以罗丹明6G为原料，利用硫的亲汞性设计合成了Hg2+探针R6G1，并对R6G1进行了1H NMR，13C NMR，MS表征，证明合成产物为所设计的目标化合物。

2）测试探针R6G1对离子的选择性时发现，R6G1能在水相中检测Hg2+，与Hg2+结合后荧光强度显著增强；R6G1与Hg2+的络合常数lgKa=5.92，表明探针R6G1在水溶液中的选择性好，灵敏度高且不受其他金属阳离子的干扰。

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（编辑 李明辉）

Synthesis and Spectrum of Mercury Ion Fluorescent Probe Based on Rhodamine Dyes

Zhang Lizhu1，Yu Lu1，Liang Kun2，Gu Lijun1，Fan Baomin1，Yang Lijuan1
（1. Key Laboratory of Chemistry in Ethnicmedicinal Resources，State Ethnic Affaira Commission ＆ Ministry of Education，Yunnan University of Nationalities，Kunming Yunnan 650500，China；2. Faculty of Science，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China）

A Hg2+fluorescence probe，3′，6′-diethylamino-2，7-dimethyl-2-(N-aminoethyl)spiro［isoindoline-1，9′-xanthene］-3-thione(R6G1)，was synthesized through the strong thionic affinity with Hg2+and the transformation of thiourea derivatives to guanidine derivatives by the promotion of Hg2+. The water solubility，spectrum and ion selectivity of R6G1 were investigated. The complexing ratio of Hg2+to R6G1 and the complexation constant were measured through fluorometric titration.The results showed that the probe R6G1 had high selectivity to Hg2+and good water solubility. The recognition process of R6G1 to Hg2+was not affected by other metal ions such as Fe3+，Cu2+，Al3+，Cr3+，Fe2+，Mn2+，Co2+，Pb2+，Mg2+，Ca2+，Cd2+，Zn2+，Ba2+，and anions such as F-，Cl-，Br-.Spectrophotometric titration indicated that the complex of Hg2+and R6G1 formed with the ratio of 1∶1 and the complexation constant(lgKa) was 5.92.

rhodamine； fl uorescent probe；mercury ion；spectral properties

1000 - 8144（2014）04 - 0461 - 05

TQ 426.91

A

2013 - 11 - 18；［修改稿日期］2014 - 01 - 20。

张丽珠（1973—），女，四川省成都市人，博士，副教授，电话 13508716745，电邮 zhanglizhu333@163.com。联系人：樊保敏，电话13888070271，电邮 adams.bmf@hotmail.com。

国家自然科学基金项目（21162040，21162042）。