淫羊藿苷对维甲酸致大鼠骨质疏松影响的研究

朱贵忱 刘明雨 孙利锋 才智 宋雪花

骨质疏松症已经成为严重威胁中老年人健康的常见病，其发病率日益增加，其发病特征是骨量减少、骨强度减弱、骨密度降低等。西药治疗骨质疏松因需长期服用，不良反应大，疗效亦不特别满意。中药在治疗骨质疏松症时有其独特的优势，因此近来成为研究骨质疏松症治疗的热点。其中，淫羊藿是中医在治疗骨质疏松时的常用药，有报道淫羊藿中的黄酮类成分淫羊藿苷能对去势致骨质疏松大鼠有防治作用［1］。本实验观察淫羊藿苷对维甲酸致大鼠骨质疏松的影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:SD大鼠，清洁级，50只，雌性，280～300 g，购自河北省实验动物中心，动物许可证号:SCXK(冀)2008-1-003。

1.1.2 试剂与仪器:淫羊藿苷，纯度＞99%，购自南京崇原生物科技有限公司;维甲酸，购自重庆华邦制药股份有限公司;钙(Ca2+)、磷(P3+)、碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)试剂盒购自北京九强公司;羟脯氨酸(Hyp)试剂盒购自南京建成生物公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与给药:SD大鼠，50只，随机分为对照组、模型组、淫羊藿苷低剂量:50 mg/kg、淫羊藿苷中剂量组:100 mg/kg、淫羊藿苷高剂量组:200 mg/kg。每组10只动物。采用维甲酸制备大鼠骨质疏松模型:上午灌胃给予维A酸70 mg/kg，连续灌胃2周，对照组仅给予蒸馏水。2周后，按10 ml/kg灌胃给予淫羊藿苷，模型组给予等体积的蒸馏水，连续给药4周。给药结束后腹主动脉取血处死动物;取左侧胫骨检测骨生物力学;右侧胫骨检测骨密度、Hyp;左侧股骨进行骨物理指标;右侧股骨检测骨生化。

1.2.2 血生化指标检测:取血，离心，生化分析仪测定血清Ca2+、P3+、碱性磷酸酶ALP、酸性磷酸酶ACP。

1.2.3 骨生化指标检测:取大鼠右侧股骨，用电感偶合等离子体直读光谱仪测定股骨中Ca2+、P3+的含量。取大鼠右侧胫骨，按说明书步骤测定Hyp的含量。

1.2.4 骨物理学指标检测:大鼠右侧胫骨，去除附着的肌肉和结缔组织，应用双能X线骨密度仪测定骨密度。取大鼠左侧股骨，剔除干净，称湿重;放置于烤箱80℃烘烤72 h至恒重，称量股骨的重量，即得干重;取骨，用游标卡尺测得股骨大转子和股骨颈汇合处最低点到股骨髁间窝的距离为股骨长度;股骨曲面的第三转子下行至股骨干交接之处，所得数值为股骨宽度。

1.2.5 骨生物力学检测:取左侧胫骨，三点弯曲实验，测量最大弯曲力、抗弯强度、断裂挠度、弹性段终点荷等生物力学参数。

1.3 统计学分析 应用SPSS 11.5统计，软件计量资料以±s表示，进行ANOVA分析处理和Dunnett检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血生化分析 模型组较正常组血清中Ca、P明显下降(P ＜0.01)，ALP明显上升(P ＜0.01)，与模型组比较，淫羊藿苷中、高剂组Ca、P显著上升(P＜0.01)，低、中、高剂组ALP均显著下降(P ＜0.01)，ACP在5组无明显改变(P＞0.05)。见表1。

表1 淫羊藿苷对骨质疏松大鼠血生化影响n=10，±s

表1 淫羊藿苷对骨质疏松大鼠血生化影响n=10，±s

注:与正常组比较，*P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.01

组别 Ca(mmol/L) P(mmol/L) ALP(U/L) ACP(U/L)2.39±0.29 2.18±0.22 70±12 4.0±0.7模型组 1.84±0.21* 1.54±0.18* 156±25* 4.4±0.7淫羊藿苷低剂组 1.89±0.19 1.60±0.16 99±14# 4.2±0.7淫羊藿苷中剂组 2.18±0.22# 1.99±0.28# 109±21# 4.2±0.7淫羊藿苷高剂组 2.33±0.27# 2.02±0.19# 89±14#正常组4.3±0.8

2.2 骨生化分析 模型组较正常组骨中Ca2+、P3+、Hyp明显下降(P＜0.01)，与模型组比较，淫羊藿苷中、高剂组Ca2+显著上升(P ＜0.05或＜0.01)，低、中、高剂组P3+、Hyp均显著上升(P ＜0.01)。见表2。

表2 淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨生化影响

2.3 骨物理指标分析 模型组较正常组骨密度、湿重、干重明显下降(P＜0.01)，与模型组比较，淫羊藿苷中、高剂组骨密度、湿重显著上升(P＜0.05或＜0.01)，低、中、高剂组干重均显著上升(P ＜0.01)，骨长、骨宽差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

2.4 骨生物力学指标分析 模型组较正常组骨中最大弯曲力、抗弯强度、断裂挠度、弹性段终点荷明显下降(P ＜0.01)，与模型组比较，淫羊藿苷低、中、高剂组最大弯曲力、断裂挠度显著上升(P＜0.01)，中、高剂组抗弯强度显著上升(P＜0.01)，高剂组弹性段终点荷显著上升(P＜0.05)。见表4。

表3 淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨物理指标影响n=10，±s

表3 淫羊藿苷对骨质疏松大鼠骨物理指标影响n=10，±s

注:与正常组比较，*P ＜0.01;与模型组比较，#P＜0.05，△P ＜0.01

组别 骨密度(g/cm2) 湿重(g) 干重(g) 骨长(mm) 骨宽(mm)正常组 0.36±0.04 1.09±0.18 0.66±0.09 33±4 3.02±0.39模型组 0.27±0.02* 0.84±0.17* 0.50±0.03* 33±4 2.95±0.29淫羊藿苷低剂组 0.28±0.03 0.98±0.15 0.57±0.06△ 33±4 3.01±0.32淫羊藿苷中剂组 0.33±0.05△ 1.05±0.21# 0.62±0.08△ 34±4 2.94±0.23淫羊藿苷高剂组 0.34±0.04△ 1.05±0.17# 0.63±0.09△33±3 3.01±0.46

表4 淫羊藿苷对骨质疏松大鼠生物力学指标影响

3 讨论

选择合适的动物骨质疏松模型是研究的关键［2］，目前建立骨质疏松模型常用的动物有大鼠、小鼠、犬、兔、绵羊，因大动物费用较高，研究者多数选择大鼠建立骨质疏松模型。复制大鼠骨质疏松模型的方法又分为手术方法和化学方法，手术法有双侧卵巢切除法、去势法，化学法有维甲酸法、糖皮质激素诱导法等。双侧卵巢切除法是切除雌性大鼠双侧卵巢，模拟临床绝经后女性骨质疏松的发生，此模型成功率高，但手术会引起大鼠创伤，且造模时间长。维甲酸是维生素A的衍生物，能够激活破骨细胞的分化、增殖，促进骨吸收，造成骨丢失，维甲酸致大鼠骨质疏松模型造模时间短，稳定，常被用于药物的骨质疏松研究［3］。选择70 mg/kg维甲酸连续灌胃2周建立大鼠骨质疏松模型，结果显示模型组大鼠血清中 Ca2+、P3+下降，ALP上升，骨Ca2+、P3+丢失，骨密度、骨生物力学、物理学指标等均下降，表明大鼠骨质疏松模型建立成功。同时也表明维甲酸建立的骨质疏松是以有机质丢失为主，进一步骨密度下降，骨韧性下降，骨脆性增高。

淫羊藿苷能防治维甲酸所致的骨质疏松，表现在淫羊藿苷能提高血、骨中的Ca2+、P3+浓度和含量，降低ALP活性，升高骨中Hyp含量，ALP活性可反映出骨形成的程度，Hyp既能反映骨吸收，又能反映骨形成，表明淫羊藿苷能防止有机质的丢失，抑制骨吸收，促进骨形成;骨密度是检测骨质疏松的常用指标［4，5］，我们观察到淫羊藿苷能显著提高骨质疏松大鼠的骨密度，表明淫羊藿苷能够提高骨密度;同时淫羊藿苷能提高骨湿重、干重，增加骨的最大弯曲力、抗弯强度、断裂挠度、弹性段终点荷等生物力学参数，进一步表明淫羊藿苷能增强骨强度，增大骨抵抗外力冲击能力，降低骨脆性，减少骨折发生，进而提示了淫羊藿苷对于维甲酸所致的骨质疏松大鼠有一定的防治作用。

1 宋渊，李盛华，何志军，等.淫羊藿苷对去势雌性大鼠骨质疏松的影响.军医进修学院学报，2012，33:400-403.

2 徐洪璋，余斌.骨质疏松症动物模型研究现状.第一军医大学学报，2002，22:47-50.

3 许碧莲，崔燎，陈文双，等.维甲酸致大鼠骨质疏松模型探讨及丹参骨宝的预防作用.中国药理学通报，2010，26:539-543.

4 Terreni A，Pezzati P.Biochemical markers in the follow-up of the osteoporotic patients.Clin Cases Miner Bone Metab，2012，9:80-84.

5 Havrda JB.Pediatric bone densitometry.Radiol Technol，2012，84:155-177.