木榄细胞膜Na+/H+逆向运输蛋白BgSOS1功能的初步验证

荆海瑜，周 扬，郭晓颖，从心黎，黄绵佳，江行玉

(1.海南大学海南省热带作物资源可持续利用重点实验室，海南海口570228;2.海南大学园艺园林学院，海南海口570228)

生长在盐渍环境中的植物主要受到渗透胁迫和离子胁迫的影响，较低的外界渗透压会引起植物吸水困难、代谢紊乱，从而导致植物生长发育停滞，甚至死亡.土壤溶液中的盐(主要是NaCl)以被动或者主动运输方式进入植物体内，细胞质中高浓度的盐离子危害植物体内重要的代谢途径，进而影响植物的生长发育.为了维持细胞正常的代谢活动，植物可以通过降低细胞质的Na+浓度来维持细胞内离子的均衡，从而降低盐离子的危害［1］.植物主要通过两条途径来降低细胞质中的Na+浓度:一是通过质膜上的Na+/H+反转运蛋白把Na+排出体外;二是通过细胞液泡膜上的Na+/H+反转运蛋白把细胞质内过多的Na+区域化至液泡中［2-4］.

对拟南芥突变体的分子遗传学分析表明，SOS(Salt Overly Sensitive)信号途径是盐胁迫的主要调控途径之一.SOS调控途径中涉及到3个蛋白:SOS1，SOS2，SOS3.在盐胁迫条件下，SOS3首先与Ca2+结合，结合Ca2+的SOS3与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SOS2相互作用，形成SOS3/SOS2复合体，从而激活SOS2的活性，活化的SOS2通过使SOS1磷酸化，激活SOS1的Na+/H+逆向运输功能，同时利用细胞膜上的H+-ATPase分解ATP产生的跨膜H+，把细胞内过多的Na+排出细胞外，从而减少Na+对细胞的危害，因此，SOS途径对维持细胞内K+和Na+的平衡和减少Na+在植物细胞乃至植物体内的积累起着非常重要的作用［2-3］.除了拟南芥以外，水稻的SOS信号系统同样在调节水稻的离子转运过程中起着重要的作用.本研究克隆了水稻SOS途径的3个基因OsSOS1，OsSOS2(OsCIPK24)和OsSOS3(OsCBL4)，并利用酵母和拟南芥突变体研究了它们的功能，鉴定了除拟南芥外的第一个完整的SOS信号途径.水稻OsSOS1的Na+/H+逆向运输活性也是通过OsSOS2-OsSOS3的互作来调控的，OsSOS2-OsSOS3的互作引起了OsSOS1的磷酸化，从而激活其Na+/H+逆向运输活性.进一步的研究发现，这两种亲缘关系较远的植物，其SOS途径无论是在结构上，还是在功能上都是高度保守的，并且对应的SOS蛋白可以功能互补［5］.可见，SOS信号系统在植物中是非常保守的.

木榄(Bruguiera gymnorhiza)属红树科木榄属植物，分布于热带、亚热带陆海交汇地区，在我国分布较广，是构成我国红树林的优势物种之一.它在防风减灾、护堤保岸、环境污染监测、净化与防治、维护海岸生态平衡等方面具有重要的作用.木榄生长环境的海水盐度可高达3.0%～3.2%，超过海水的平均盐度.木榄没有盐腺，但其根部能把吸收到体内的99%的盐分再排出体外［6］，因此，它是研究植物质膜Na+/H+逆转运蛋白SOS1功能的绝好材料.到目前为止，木榄细胞膜Na+/H+逆转运蛋白功能及其调控机理的研究还未见报道.所以基于以上原因，研究SOS2/SOS3对木榄细胞膜Na+/H+逆转运蛋白BgSOS1活性的影响，将有助于理解木榄中SOS途径的调控和揭示木榄的耐盐性机理，从而为探讨植物的耐盐机理提供理论证据，同时，也为培育具有较强耐盐性的作物提供材料.

1 材料与方法

1.1 植物材料及处理 植物材料为木榄叶片，取自海南东寨港红树林国家自然保护区.用无菌水将叶片冲洗干净，待滤纸吸干其表面的水分后，放入液氮中速冻，最后置于-80℃的低温冰箱中保存，以备提取RNA.

1.2 酵母和载体 酿酒酵母突变体菌株 AXT3K(ena1∶∶HIS3∶∶ena4，nha1∶∶LEU2，nhx1∶∶KanMX4)来源于野生型酵母W303，不能编码腺嘌呤(Adenine)、尿嘧啶(Uracil)和色氨酸(Tryptophan).AXT3K缺失了内源的NHX1蛋白，质膜Na+转运蛋白NHA1和钠离子泵ENA1-4，不能转运Na+，因而对Na+特别敏感，与野生型酵母W303相比，AXT3K突变体在含有 NaCl培养基上的生长受到明显抑制［7］.根据实验的需要，这些酵母分别在APD培养基和YNB培养基中培养.YNB培养基用来培养转基因酵母:w=0.67%的酵母氮基(不含氨基酸)，w=2%的葡萄糖和筛选所用氨基酸;APD培养基用于后面的酵母功能互补试验:10 mmol·L-1的精氨酸，8 mmol·L-1的磷酸，w=2% 的葡萄糖，2 mmol·L-1的 MgSO4，1 mmol·L-1的KCl，0.2 mmol·L-1的 CaCl2，微量元素和维生素，用NaOH调节pH值至6.5.

pYPGE15是酵母高效表达的载体，具有H+-ATPase基因的启动子，编码氨苄青霉素基因(Ampi)和尿嘧啶基因.pFL32T来源于pFL质粒，含有拟南芥SOS2(AtSOS2)和SOS3(AtSOS3)基因.这两个载体在所发表的论文中已被详细地描述［8］.

1.3 木榄总RNA的提取和第一链cDNA的合成 木榄叶片总RNA的提取采用TRIzol(invitrogen公司产品)法，并以木榄叶片总RNA样品为模板，按照Thermo反转录试剂盒操作说明进行反转录反应，合成第一链cDNA.

1.4 BgSOS1基因的克隆和酵母表达载体的构建 根据GenBank公布的木榄BgSOS1蛋白基因的mRNA序列(GenBank NO.∶HM054521)，采用Primer premier 6.0软件设计引物，扩增BgSOS1全长序列，引物序列如下:正向引物BgSOS1F:5＇gcTCTAGAATGGCGACGGTTTTCGGGGCG 3＇(含Xba I酶切位点);反向引物BgSOS1R:5＇gcGGTACCCTAAAAAGCCTGGCGGAAACA 3＇(含Kpn I酶切位点);中间1541碱基处的正向引物 BgSOS1F1541:5＇CATCTGAATCTGATGATGATC3＇;中间 1650处的反向引物 BgSOS1R1650:5＇TATCCTTCCCTCATCGATCAT3＇.以 cDNA为模板，然后分别利用 BgSOS1F和 BgSOS1R1650与 Bg-SOS1F1541和BgSOS1R两对引物进行PCR，克隆得到BgSOS1的前后两个片段.两段PCR产物分别用Xba I和Cla I以及Cla I和Kpn I双酶切，酶切产物纯化后依次连接到酵母表达载体pYPGE15中，内切酶和用于连接的T4 DNA Ligase均购自Promega公司，构建的重组质粒命名为pYPGE15-BgSOS1.

1.5 BgSOS1基因的功能验证 利用PEG-LiAc转化法将pYPGE15，pYPGE15-BgSOS1和pFL32T分别转入酵母突变体AXT3K中.根据AXT3K的营养缺陷型和pYPGE15与pFL32T载体上带有的尿嘧啶(U-racil)和色氨酸(Tryptophan)的合成基因，在YNB固体培养基上筛选转基因酵母.野生型酵母W303、转化pYPGE15的AXT3K、转化pYPGE15-BgSOS1的AXT3K、共转化pYPGE15-BgSOS1和pFL32T的AXT3K分别在APD液体培养基中预培养至饱和，稀释50倍后再按10倍梯度稀释，最后，根据实验需要，利用Drop Test方法从稀释液中取10 μL 分别点在含 0，50，100，200，400 mmol·L-1NaCl的 APD 固体培养基上，30℃培养3～5 d后，照相并记录酵母生长情况.

2 结果与分析

2.1 BgSOS1基因的克隆 根据GenBank中木榄Na+/H+逆向转运蛋白基因BgSOS1的序列信息(Gen-Bank NO.∶HM054521)设计引物BgSOS1F和BgSOS1R，从木榄叶片中提取总RNA并反转录，用BgSOS1F和BgSOS1R引物扩增检测，但并未发现目的条带，考虑到这可能是因为基因过长，从而导致RT-PCR不能正常工作之缘故，所以又根据基因序列信息，发现了在BgSOS1的1634碱基处存在一个Cla I酶切位点，该酶切位点刚好也位于本实验使用的酵母表达载体pYPGE15的多克隆位点.鉴此，在基因1 541 bp和1 650 bp各设计一个正向引物(BgSOS1F1541)和一个反向引物(BgSOS1R1650)，然后分别利用BgSOS1F和BgSOS1R1650与BgSOS1F1541和BgSOS1R两对引物进行RT-PCR，经琼脂糖凝胶电泳检测，分别发现长度大约为1 900 bp和1 600 bp的两个条带(见图1A).这表明可能得到了中间有一部分序列重叠的5＇端和3＇端的基因片段，并且在重叠部分都含有Cla I酶切序列.然后分别酶切以上两个片段，分两步插入酵母表达载体pYPGE15中，得到pYPGE15-BgSOS1融合载体.转化大肠杆菌DH5α菌株，挑取单克隆进行菌液PCR，初步筛选阳性克隆.将鉴定好的菌液送往上海生物工程公司测序，测序后发现该片段的长度为3 462 bp(见图1B)，这与GenBank中BgSOS1的序列一致.

图1 BgSOS1全长基因的克隆

2.2 BgSOS1基因编码的氨基酸同源性分析 采用DNA MAN 6.0软件，将克隆得到的BgSOS1氨基酸序列与拟南芥、小麦、西红柿、盐芥、杨树和水稻的Na+/H+逆向转运蛋白的氨基酸序列进行同源性分析，结果发现，它们的相似度较高，分别为63.86%，60.19%，66.61%，63.97%，75.97%和62.18%(见图2A).模式植物拟南芥中有8个同源性较近的Na+/H+逆向运输蛋白(AtNHX1-AtNHX8)，它们的功能已被详细研究［9-13］.其中AtNHX1-6定位在内膜系统上，主要通过Na+(K+)/H+逆向运输的功能调控细胞内的pH和钾离子平衡;AtNHX7即拟南芥质膜Na+/H+逆向运输蛋白AtSOS1;AtNHX8也位于细胞膜上，专一地调节Li+/H+逆向运输［14］.同源性比较还发现，BgSOS1与 AtNHX7(AtSOS1)最相近，同源性高达63.86%，而与内膜系统分部的Na+/H+逆向运输蛋白AtNHX1-6的亲缘关系较远，同源性仅为19%(见图2B).蛋白序列比对和系统发育分析都说明BgSOS1可能位于质膜上，推测其具有将细胞内的Na+排到胞外的功能.

图2 植物离子转运系统Nhap/SOS1和NHE/NHX蛋白的进化树分析

2.3 BgSOS1基因编码的氨基酸序列分析 理化性质分析表明，BgSOS1包含3 462 bp的核苷酸序列，编码1 154个相对分子质量约为126.9 kDa的蛋白质.疏水性/亲水性分析(参考Espasy的Protscale软件)表明，整个BgSOS1蛋白表现为疏水性，与膜蛋白疏水性的特征一致.运用TMHMM软件进行跨膜性分析，结果表明BgSOS1蛋白可能含有12个跨膜区域.N端具有高度疏水性，亲水性C端较长，残留在细胞质内(见图3).BgSOS1蛋白N端的12个跨膜结构域与拟南芥、西红柿、水稻或小麦细胞膜Na+/H+逆向转运蛋白非常相似;尽管C端的差异相对较大，但也含有SOS2/SOS3蛋白激酶复合体结合的磷酸化调控结构域DSPS(见图4)，表明BgSOS1的Na+/H+逆向转运功能也可能受SOS2/SOS3蛋白激酶复合体的磷酸化调控.

图3 BgSOS1蛋白的跨膜性分析

图4 植物SOS蛋白的序列比对

2.4 利用酵母突变体验证BgSOS1基因的功能 出芽酵母是研究离子运输特性的模式生物，相应的突变体是在分子生物学水平上研究高等生物离子运输蛋白功能的优良工具［15］.AXT3K是一种缺少细胞膜上Na+运输蛋白的酵母突变体.在盐胁迫情况下，由于AXT3K缺失细胞膜上负责Na+外排的运输蛋白，以至于进入AXT3K细胞内的Na+相对地不能运出细胞，从而导致细胞质内过多的盐离子对酵母细胞产生毒害.所以酵母突变体AXT3K在含50 mmol·L-1NaCl的培育基上不能生长.生物信息学分析表明，BgSOS1可能是一种Na+运输蛋白，所以，为了研究该蛋白的功能，BgSOS1基因被转进酵母突变体AXT3K内，以研究该基因影响AXT3K对盐胁迫的反应.在正常培养基上，转基因酵母和非转基因对照酵母的生长情况没有差异;单个转BgSOS1基因对AXT3K的抗盐性没有影响(见图5A)，这表明该基因可能没有被激活;但3个基因BgSOS1、AtSOS2和AtSOS3共同转化酵母的抗盐性明显提高，以至于在含400 mmol·L-1NaCl的培养基上都能生长(见图5B);作为阴性对照，AtSOS2和AtSOS3无论单独或者共同转化酵母都不能影响转基因酵母的抗盐性(数据没有显示)，相似的结果已在所发表的论文中报道了［5］.这表明BgSOS1必须受SOS2/SOS3激酶复合体磷酸化激活才可能具有Na+/H+反向运输的功能.

3 讨论

图5 转BgSOS1酵母的耐盐性分析

Na+/H+逆向转运蛋白是负责Na+、H+交换的一种跨膜运输蛋白，它广泛存在于高等植物细胞内.按照序列同源性以及在细胞内的位置可被分成两个亚组，分布在细胞膜上的SOS1类蛋白和位于内膜系统上的NHX类蛋白［16］.SOS1定位于细胞膜上，具有Na+/H+逆向运输的功能，可以利用细胞膜上的H+-ATPase分解ATP产生的H+梯度把细胞内过多的Na+运输到细胞外，从而提高盐胁迫环境中植物的抗盐性［2-3，5，7］.内膜系统上的NHX类Na+/H+逆向运输蛋白可通过Na+(K+)/H+的逆向运输功能调控植物细胞内钾离子和pH平衡，也可利用液泡上的H+-ATPase和焦磷酸化酶分解ATP产生的H+梯度把细胞质中过多的Na+运输到液泡内，从而提高盐胁迫植物的抗盐性［16］.BgSOS1与已经报道的具有Na+/H+逆向运输功能的几种植物SOS1的同源性很近，而和定位在内膜系统上的NHX类的Na+/H+逆向运输蛋白的同源性较低，这些都表明BgSOS1可能是一种细胞膜定位的Na+/H+逆向运输蛋白，与木榄的抗盐性有密切的关系.

在SOS途径中，SOS1负责Na+/H+反向运输，它是至今发现的细胞膜上唯一能把Na+从细胞内运输到细胞外的蛋白质，所以它与植物耐盐性的关系最直接.已报道的几种植物SOS1的结构同源性非常高.SOS1基因编码一个相对分子质量约为127 kDa的多肽，其高度疏水特性的N端包含12个跨膜区域，长的亲水性C端分布在细胞质中，SOS1是已知最大的Na+/H+逆向转运蛋白［5，17］.最近，根据拟南芥SOS1的C端尾部的结构特点，初步研究了位于这个蛋白尾部上的功能调节区域，发现了拟南芥SOS1的活性调节区，即磷酸化调节位点［8］.BgSOS1有1 154个氨基酸，也含有12个跨膜区域.N端具有高度疏水性，C端亲水性较强，残留在细胞质内.不同植物中SOS1蛋白N端的跨膜区结构非常相似;C端差异尽管相对较大，但也含有SOS2/SOS3蛋白激酶复合体结合的磷酸化调控结构域(见图4)，表明BgSOS1的Na+/H+逆向转运功能也可能受SOS2/SOS3蛋白激酶复合体的磷酸化调控.

酵母能利用细胞膜上的 Na+泵(Na+pumps，ENA proteins)和Na+/H+逆向运输蛋白NHA1把细胞内过多的Na+运输到细胞外，从而提高酵母的抗盐性［18-19］.所以缺失Na+外向运输蛋白的酵母突变体由于不能把细胞内有毒性的Na+运出细胞而对盐胁迫特别敏感.一些植物SOS1基因在Na+/H+逆向运输蛋白NHA1缺失的酵母突变体内表达，可通过降低酵母细胞内的Na+含量来显著提高转基因酵母的抗盐性.AXT3K是一种缺失运输Na+的酵母突变体，在含50 mmol·L-1的NaCl培养基上不能生长.异体表达的BgSOS1并没有提高转基因酵母AXT3K的抗盐性，该结果与其他植物SOS1可明显提高转基因酵母抗盐性的实验结果不同，但本实验的结果与只有SOS2/SOS3蛋白激酶复合体磷酸化激活SOS1才具有Na+/H+逆向运输活性的观点一致［8］.盐胁迫条件下，拟南芥SOS3首先与Ca2+结合，结合Ca2+的SOS3与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SOS2相互作用而形成SOS3/SOS2复合体，从而激活SOS2的活性，活化的SOS2通过使SOS1磷酸化，激活SOS1的Na+/H+逆向运输功能，同时利用细胞膜上的H+-ATPase分解ATP产生的跨膜H+梯度，把细胞内过多的Na+排出细胞外，从而减少Na+对细胞的危害，因此，SOS途径对维持植物细胞内K+和Na+的平衡，减少Na+在植物细胞乃至植物体内的积累起着非常重要的作用［2-3］.本文研究了拟南芥AtSOS1结构与其功能的关系，鉴定了AtSOS1序列上的磷酸化结构域，即SOS2/SOS3蛋白激酶复合体可与AtSOS1序列C端上的DSPS结合，使AtSOS1磷酸化［8］.BgSOS1的C端也含有和拟南芥SOS1磷酸化结构域一样的DSPS序列(见图4)，并且SOS1，SOS2和SOS3共同表达的酵母突变体AXT3K的抗盐性明显提高，在含400 mmol·L-1NaCl的培养基上都能生长(见图5).这些都表明SOS2/SOS3蛋白激酶复合体也可能通过使BgSOS1磷酸化来调节其Na+/H+逆向运输的功能，相应地，SOS途径也可能是盐生植物木榄抗盐的重要机理之一.

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