华南地区海水养殖鱼类主要弧菌病原的分离与鉴定

崔 婧，范雪亭，刘文竹，李红月，周永灿，王世锋，谢珍玉

(海南大学 海洋学院，海南省热带水生生物技术重点实验室，海南 海口570228)

海水鱼类的种类丰富，可选择的养殖品种较多，而我国适宜养殖的辽阔海域也为海水养殖业提供了场所. 目前，我国试养的海水鱼类累计已达80 多种(包括部分引进种)［1］，其中大规模养殖的有30 多种.在2012 年渔业产值中，海水养殖的产值已达2 264.54 亿元，实现增加值1 308.18 亿元［2］. 不过，随着海水鱼类养殖规模的不断扩大，大面积频繁暴发的养殖鱼类重大流行性疾病已成为制约海水鱼类养殖业发展的最主要瓶颈之一.

引起海水养殖鱼类病害的原因众多，除受营养性因素和环境因素影响外，细菌、病毒和寄生虫等均可引发传染性疾病. 由于细菌感染引起的疾病具有流行面广、发病迅速、死亡率高、危害大等特点，所以它一直是国内外的研究重点. 目前，已报道的海水养殖鱼类细菌性疾病有十余种，其中弧菌病(Vibriosis)被公认为是对海水鱼类养殖危害最大的病害之一，它也一直是我国华南地区海水养殖鱼类的主要细菌性病害［3］，引发该病的病原主要有:哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、鳗弧菌(V. anguillarum)、需钠弧菌(V. natriegens)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、灿烂弧菌(V. splendidus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、轮虫弧菌(V. rotiferianus)、创伤弧菌(V. vulnificus)、杀鲑弧菌(V. salmonicida)、海利斯顿氏菌(V. pelagius)、美人鱼弧菌(V. damsela)、奥氏弧菌(V. ordalii)、费氏弧菌(V. fischeri)以及最小弧菌(V. mimicus)等［4－6］. 近年来，华南地区海水养殖鱼类的多次大面积流行性疾病均呈现弧菌病典型症状，为此，笔者连续3 年在该地区开展了弧菌病的流行病学调查，旨在确定这些重大流行性疾病的主要弧菌病原，以便为今后有效控制该类疾病的爆发和流行奠定初步的基础.

1 材料与方法

1.1 流行病学调查及病原菌的分离 调查时间:2011 年5 月～2013 年10 月

调查地点:海南省文昌市铺前镇、海南省陵水市新村港、海南省三亚市南山港、广西壮族自治区北海市西村港、广东省深圳市大亚湾.

调查内容:询问并记录华南地区海水养殖鱼类的发病时间及发病规律;测量发病鱼排与养殖池塘的水温、盐度、pH 值;观察和记录患病鱼的体表症状和解剖症状.

调查方法:参考周素明［7］的方法并作适当改良. 即:从每个采样点随机挑取3 口网箱或池塘，每口网箱或池塘分别取3 尾具有典型病症的鱼;用TCBS 平板划线分离法从病鱼的体表病灶、肝脏、脾脏、头肾、心脏分离细菌［8］，30 ℃培养24 h 后记录结果. 挑取菌落形态一致的优势菌，并以TCBS 培养基纯化培养2～3 次，直至获得纯培养菌. 同时，将优势菌株用普通海水营养液体培养基培养(每1 000 mL 中，酵母浸膏1.0 g，牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 30.0 g，调pH 至7.6 ～7.8)，菌悬液与等体积φ=50%的甘油混合，保存于－80 ℃的冰箱中备用.

1.2 病原菌确定 由于斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)是我国华南地区近二十年来石斑鱼养殖中最主要的养殖种类之一，也是本次调查中发病最多的鱼类，因此选取斜带石斑鱼作为人工感染试验的动物.选取健康斜带石斑鱼(体重30 ～35 g)，用过滤海水暂养7 d 后，5 条/组饲养在48 cm×38.5 cm×38.5 cm(长×宽×高)的玻璃缸中，水深约25 cm，连续充气，日换水量为水体的1/3. 将从患病鱼中分离的优势菌株经普通海水营养液体培养基扩大培养后，用无菌生理盐水(w =0.85%)稀释成1.1 ×107CFU/mL 的菌悬液;腹腔注射，接种量0.2 mL/尾，对照组注射等量的无菌生理盐水;每组5 尾，设1 个重复. 记录感染后15 d 内各组石斑鱼的发病及死亡情况，并对发病个体进行细菌重分离，接着将重分离菌株做重感染试验. 当病鱼的发病症状相同，且所分离和重分离菌株的菌落形态与人工感染菌株的菌落形态完全相同时，则确定该菌株为致病菌株(柯赫氏法则). 根据大量哈维氏弧菌的人工感染经验得出，在哈维氏弧菌感染鱼体后，24 h 内出现发病死亡现象的菌株为强毒株，24 h 后发病的菌株为弱毒株，15 d 内不发病的菌株为无毒株.

1.3 病原菌的菌种鉴定

1.3.1 16S rDNA 以及管家基因topA，mreB 基因序列的测定与分析 病原菌经30 ℃振荡培养20 h 后，以菌液为模板PCR. 扩增基因16S rDNA、管家基因topA 和mreB 的引物序列分别参照Ana Cano－Gomez 等［9］的方法，引物由华大基因公司合成.25 μL PCR 反应体系:10 ×Taq Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTPs Mix(10 mmol/L)0.5 μL，20 μmol/L 正反向引物各1 μL，Taq DNA 聚合酶(5U/μL)0.2 μL，模板DNA 1 μL，无菌水18.8 μL. PCR 扩增条件:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸2 min，30 个循环;最后于72 ℃温育10 min，并以w=1%的琼脂糖凝胶电泳观察结果. 采用中科瑞泰(北京)生物科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒对PCR 产物进行回收. 连接pMD19－T Vector，筛选阳性克隆送华大基因公司进行核苷酸序列的测定. 采用MEGA 5 软件，将强毒株GDH11385 的16S rDNA 序列、topA 与mreB 的串联序列分别与从GenBank 中获得的同源性最高的细菌16S rDNA 序列、topA 与mreB 的串联序列进行比对，构建系统进化树.

1.3.2 表型鉴定 参照Mercedes－Anicel［10］和东秀珠等［11］的方法进行形态学和生理生化检测鉴定. 生化鉴定管及相关试剂均购自杭州微生物有限公司. 选取的生理生化指标包括:4 ℃生长、28 ℃生长、35 ℃生长、40 ℃生长、w=0 %的NaCl 生长、w=2 %的NaCl 生长、w=6 %的NaCl 生长、w=8 %的NaCl 生长、w=10 %的NaCl 生长、TCBS 上生长颜色、革兰氏染色、水解木糖、水解蔗糖、水解乳糖、水解鼠李糖、水解阿拉伯糖、水解葡萄糖、葡萄糖(产气)、肌醇、甘露醇、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解、枸缘酸盐、硝酸盐还原、ONPG、吲哚试验、O/129(10 μg)、O/129(150 μg).

2 结 果

2.1 流行病学调查及病原菌分离 调查结果表明，每年5 ～10 月为发病高峰期;发病池水体的盐度为28±5，pH 值为7，4 ±0.4，水温为(28 ±3)℃. 不同地点、不同种类鱼的发病症状存在一定差异. 其中，海南省琼海市潭门镇的红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus)在发病初期伏底、不活动、反应迟钝，在后期其体表的不同区域脱鳞溃烂，通过对患病鱼的解剖可见，其肝脏充血、肿大，腹腔积水;海南省文昌市铺前镇的红鳍笛鲷的发病症状为体表脱鳞溃烂，患病鱼的解剖内脏无明显异常;而在各地调查的斜带石斑鱼、褐点石斑鱼(E. fuscoguttatus)和珍珠龙胆(棕点石斑鱼E. fuscoguttatus♀×鞍带石斑鱼E. lanceolatus♂)等病鱼都表现为眼球混浊突出，严重时眼球充血，全身大面积脱鳞溃烂(见图1)，以背部最为严重，肝脏充血并出现白斑.

图1 发病的珍珠龙胆(棕点石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂)

细菌分离结果表明，在所采集的135 份样品中，共有70 份肝脏、脾脏、头肾、心脏样品，从它们都可分离出菌落形态相对单一的菌株，而且，同一尾病鱼的不同内脏部位所分离的细菌在TCBS 培养基上的菌落形态基本一致，细菌含量为(4 ～50)×105CFU/g;从病灶处也可分离获得相应数量的细菌，其中优势菌落的形态与从内脏分离的细菌相同，但常夹杂少量其他菌落形态的细菌. 将这70 份样品的分离物培养24 h后，形成的菌落直径为1 ～3 mm，大多数菌落为黄色，少数菌落呈绿色;最终，从不同病鱼的肝脏、脾脏、头肾、心脏和创伤部位总共分离获得优势细菌63 株(见表1).

表1 2011 年5 月—2013 年10 月所采集的菌种信息及分子鉴定结果

2.2 病原菌确定 菌株GXH11001，GXH11003，GXH11004，GXH12001，GXH12003，GDH11385，GDH11387，GDH12388，GDH133899，XC11155，XC13156，XCH130211，NSH121632，NSH121251，NSH131652，WCH11DH52，WCH11D151，WCH12DH11，WCH12H252，WCH12D262，WCH13DH31 均可使石斑鱼致病.其中，在感染后12 h 内GDH11385 致使所有测试鱼死亡;而在感染后24 h 内GDH11387 也致使所有测试鱼死亡;不过被GDH11388 和GDH11389 感染后的24 h 内，鱼会开始出现死亡，死亡率为50%，但在3 d内所有测试鱼均死亡;被GXH11003，NSH131652，WCH12DH11，WCH12H252 感染后，在24 h 内均会出现鱼死亡的现象，死亡率分别为10%，30%，20%，10%，15 d 内所有测试鱼均死亡. 其余14 株菌株，在感染后15 d 内的致死率分别为20% ～40%. 人工感染时，死亡个体的肝脏充血，死亡时口和鳃明显张大. 对人工感染患病个体的肝脏、脾脏和头肾重进行分离，可获得大量与感染菌株菌落形态相同的细菌，这些重分离菌株对供试动物的毒力与原感染菌株的毒力基本相同. 因此，根据科赫法则，最终认定上述21 株为病原菌株，其中GDH11385，GDH11387，GDH12388，GDH13389 为强毒株，以GDH11385 的毒性为最强，其余17 株为弱毒株.

2.3 病原菌的鉴定

2.3.1 16S rDNA，topA 和mreB 基因序列比对与聚类 经扩增和测序，分别获得了63 株菌株的1 511 ～1 514 bp 的16S rDNA 片段，802 ～993 bp 的topA 基因片段、960 ～1 017 bp 的mreB 基因片段.16S rDNA，topA和mreB 基因序列在Genbank 中的同源性比对结果显示，43 株细菌与哈维氏弧菌的同源性最高，7 株为溶藻弧菌，5 株为副溶血弧菌，2 株为轮虫弧菌，1 株为需钠弧菌，5 株为无法确定的弧菌属其他种细菌(见表1)，序列相似性均达到99%以上. 将强毒株GDH11385 的16S rDNA 序列与Genbank 中同源性最高的且已鉴定到种的25 个菌株的基因序列进行同源性比对并构建系统分支图，结果表明，该菌株与哈维氏弧菌FJ605240.1，FN554612.2，FN554614.2 聚为一支，与轮虫弧菌、需钠弧菌、溶藻弧菌分支明显(见图2). 同时，GDH11385 的topA 和mreB 基因的串联序列与哈维氏弧菌菌株相应序列也具有最高同源性，达99%，不过，将其与Genbank 中同源性最高的20 个菌株的topA 和mreB 基因的串联序列进行比对，聚类结果显示，该菌株单独聚为一支(见图3).

图2 16S rDNA 序列构建的系统分支图

图3 TopA 和MreB 基因序列构建的弧菌系统分支图

2.3.2 表型鉴定 以哈维氏弧菌标准菌株为对照，对Genbank 中与哈维氏弧菌具有高度同源性的43 株细菌进行形态和生理生化特征的鉴定，这43 株细菌可以分为4 类，第一类以西村港分离到的细菌为代表，A 共有:GXH11001，GXH11002，GXH11003，GXH11004，GXH12001，GXH12002，GXH12003，GXH13001，GXH13002， GXH13003， WCH11D151， WCH12DH11， WCH12H252， WCH12DH11， WCH13D131，WCH13D231，WCH13D121，XCH110351，XCH110351，XCH110351，XCH110351，XCH120452，NSH111651，NSH121841，NSH131451，NSH131631，GDH12388 等菌株;第二类以铺前镇分离到的细菌为代表，B 共有:WCH12D251，WCH12D262，WCH13DH31，WCH13DH51，NSH131652，GDH13389 等菌株;第三类以铺前镇和南山港分离到的细菌为代表，C 共有:WCH11D222，WCH11DH52，WCH13DH21，WCH13D261，NSH111051，NSH111341，NSH121251，NSH131751，GXH13005 等菌株;第四类以大亚湾分离到的细菌为代表，D 共有:GDH11385，GDH11387，XCH130211，GXH13004，NSH131241 等菌株. 与标准菌株相对比，第一类细菌在水解赖氨酸和硝酸盐还原的能力上存在差异，第二类在水解糖、精氨酸双水解和硝酸盐还原能力上存在差异，第三类细菌在水解甘露醇、赖氨酸和硝酸盐还原能力上存在差异，第四类细菌在水解蔗糖、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解能力上存在差异(见表2). 因此认为，这43 株菌的生理生化表型符合哈维氏弧菌的表型特征. 结合上述分子鉴定结果，这43 株菌株最终均被认定为哈维氏弧菌.

3 讨 论

弧菌病是华南地区海水养殖鱼类最常见的细菌性疾病之一，其致病原主要为鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌等［12－14］. 本文的调查结果表明，近3 年来，该病多于每年的5 ～10 月份水温较高时爆发，养殖密度高时更易发生，多种不同生长时期的鱼类都可发病;本次实验共调查了15 个点，获得了135份样品，从中分离出63 株弧菌，其中21 株为病原菌，在这些病原菌中18 株为哈维氏弧菌(占85.7%)，这说明引起华南地区海水养殖鱼类弧菌病的主要病原为哈维氏弧菌，该病原引起的弧菌病具有感染率高、死亡量大等特点. 国内外大量的研究表明，哈维氏弧菌易感染斜带石斑鱼、褐点石斑鱼、大黄鱼等多种海水养殖鱼类［15－20］. 本研究还发现，哈维氏弧菌易感染红鳍笛鲷、珍珠龙胆等，不仅可引起感染对象鳞片脱落、皮肤坏死、肌肉溃烂等严重病灶，而且还会引起病鱼的肝脏、脾脏、头肾等多种内脏器官充血、产生白斑等病变，其中，该病原对红鳍笛鲷存在致病性为本文首次报道. 人工感染试验表明，除慢性发病的斜带石斑鱼表现出眼球突出、溃烂、内脏充血等感染症状外，本文还首次发现急性死亡的病鱼出现口、鳃张大，即表现出明显的缺氧症状，表明本研究所采集到的哈维氏弧菌对斜带石斑鱼的侵染器官与前人［18－20］获得的哈维氏弧菌对斜带石斑鱼的侵染靶器官可能不同，该病原不仅侵染试验动物的皮肤、眼、内脏，而且还可能侵染呼吸系统或呼吸控制系统. 同时，虽然GDH11385 菌株的topA 和mreB 基因均与哈维氏弧菌具有最高同源性，但是在聚类图中该菌株单独聚为一支. 因此，GDH11385 菌株的表位种类或结构、侵染机制以及遗传特征均与已报道的菌株存在明显差异，因此它可能为一类新的病原菌株.

表2 4 类待测菌株和哈维氏弧菌标准菌株的形态及生理生化特征

大量研究表明，哈维氏弧菌在TCBS 培养基上的菌落颜色均为黄色［4，18－19］，但也有研究结果显示，哈维氏弧菌在TCBS 培养基上可形成绿色菌落，其哈维氏弧菌菌株为致病菌株［21－22］. 本研究中获得的哈维氏弧菌GDH11385 不仅在TCBS 培养基上的菌落颜色为绿色，而且也是强毒株，这与前人的研究结果一致.

菌株形态及生理生化特征的分析结果表明，西村港的菌株基本都聚为一支，其他地区的菌株则分散在另三类中. 据此推测:西村港菌株有可能保持了原始地理种群的特征，其他地点的菌株则有可能因地域之间的苗种和亲本引入等人为因素而导致了菌株间的相互交流，这种菌株交流行为有可能促进了哈维氏弧菌的竞争与变异化，从而导致该疾病的大面积流行和新毒力菌株的产生.

综上所述，本次在华南地区海水养殖鱼类中分离的哈维氏弧菌病原具有毒性大、耐药性强、可侵染多种宿主的特点，同时，该菌存在不同的地理种群. 因此，在当前无法确定哈维氏弧菌病原致病机理的情况下，确立华南地区各主要养殖区哈维氏弧菌的主要遗传型毒力菌株的生物标志和建立其快速分子检测方法是目前防治哈维氏弧菌病大面积流行的有效手段.

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