水稻组蛋白单泛素化连接酶基因(OsHUB1)的克隆及其表达分析

刘云霄，向 鹏，罗红丽

(海南大学海南省热带作物资源可持续利用重点实验室，海南海口570228)

组蛋白是染色体的结构蛋白，它能够与DNA结合而形成核小体，是核小体的基本组成单位［1］.组蛋白可以发生多种修饰，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化以及ADP核糖基化等［2］，这些共价修饰能够通过改变DNA双链与组蛋白的亲和性来改变染色质构型，或者通过影响反式作用因子与启动子的亲和性来调控特定基因的表达.这些共价修饰之间存在协同和级联效应，能够通过多种修饰方式的组合发挥其调控功能，从而维持生物体的正常生长发育，并对不同生物和非生物的胁迫作出响应［3-5］.

组蛋白泛素化修饰包括多泛素化和单泛素化2种类型，其中单泛素化修饰多发生于组蛋白H2A和H2B上［6-10］.目前，在植物中只发现2个组蛋白H2B单泛素连接酶基因，即在拟南芥中与BRE1基因同源的AtHUB1和AtHUB2基因，它们的编码产物都包含一个保守的RING指结构域，属于RING型E3连接酶.这类蛋白广泛参与调控植物的生长发育，在细胞分裂、生长、花期、光形态建设及种子休眠等方面发挥功能.研究发现，HUB1-1基因缺失突变体与野生型相比，其株型明显变小、核内DNA量减少而复制增加、在DNA复制后期(G2)向分裂期(M)转化的特异基因表达量降低，表明AtHUB1的缺失阻滞了HUB1-1突变体中细胞分裂由G2-to-M的转化［11］.拟南芥FLC基因(Flowering Locus C)是重要的花期调控基因.研究发现，FLC基因所在的染色质组蛋白H2B能够被AtHUB1进行单泛素化修饰，这种修饰可以促进H3组蛋白在K4和K36位点发生甲基化，进而激活FLC及相关基因的表达，导致植物表现晚花表型［12-14］.另有研究报道，拟南芥HUB1介导的H2B组蛋白单泛素化与种子休眠有关，当T-DNA插入突变体ΔHUB1中时休眠相关基因的表达受到了抑制，种子表现出休眠缺陷表型，而且该作用与ABA介导的信号途径有关［15-16］;同时，拟南芥H2B组蛋白单泛素化修饰还参与了光形态建设和生物钟的调节［17-18］.此外，拟南芥AtHUB1是腐生病原真菌防卫反应的调节组分，其功能缺失突变体ΔHUB1对腐生病原真菌Alternaria brassicicola和Botrytis cinerea表现出高度的感病［19］.

本研究通过RT-PCR技术克隆了水稻中的一个RING型组蛋白H2B单泛素化连接酶基因OsHUB1，初步分析了该基因的结构和表达模式.研究表明:该基因的表达受到了植物激素SA和JA的诱导，它可能参与了植物中由SA和JA介导的信号途径，这为进一步研究该基因的功能奠定了基础.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 日本晴(Orazy sativa‘Nipponbare’)，

1.1.2 质粒和菌株 pGEM-T easy购自Promega公司，大肠杆菌感受态DH5α购自北京艾德生物科技有限公司.

1.1.3 试剂盒、工具酶及生化试剂 植物总RNA Trizol试剂盒、DNaseⅠ购自Invitrogen;反转录试剂盒、Pyrobest高保真酶购自TaKaRa公司;DNA回收试剂盒、Taq DNA Polymerase以及各种限制性内切酶和PCR相关试剂均来自NEB公司;引物合成由Invitrogen公司合成，测序由上海生工完成.

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 按照Invitrogen公司Trizol试剂盒说明书提取.

1.2.2 RT-PCR扩增OsHUB1基因 根据拟南芥HUB1(At2g44950)的碱基序列，通过Rice Genome Annotation Project BLAST Search进行Blastx在线比对，获得水稻中同源基因的碱基序列(基因序列号:LOC_0s4g46450).根据该序列设计扩增OsHUB1基因开放阅读框的特异性正向引物(OsHUB1-F:5＇-ATAGGATCCATGGGGAGCACGGGGGAGCCC-3＇)和 反 向 引 物 (OsHUB1-R:5＇-GCGGGTACCTATGTAGATAGGTTTCACGTC-3＇)，并按照反转录试剂盒的说明进行cDNA合成.以合成的cDNA为模板，进行PCR扩增.具体反应体系为:10×Pyrobest buffer(Mg2+plus)5 μL，基因特异性正向引物OsHUB1-F和反向引物Os-HUB1-R 各 1 μL，dNTP mix(2.5 mmol·L-1)4 μL，cDNA 1 μL，高保真酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL，ddH2O 37.5 μL.PCR反应条件如下:95℃ 4 min;95℃ 35 s，55℃ 45 s，72℃ 4 min，共32个循环;72℃ 5 min.反应结束后，以w=1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，随后，待条带回收后送往公司测序.

1.2.3 生物信息学分析 用DNASTAR软件分析OsHUB1基因cDNA全长核苷酸序列和推测氨基酸序列;随后在NCBI数据库中将OsHUB1的氨基酸序列与Genebank中已经发布的氨基酸序列进行BLAST比对.不同物种的HUB蛋白氨基酸序列的同源性比对是利用Lasergene软件完成的.

1.2.4 样品处理 分别用浓度为0.1 mol·L-1的SA和JA喷洒于三叶期水稻幼苗的叶片表面，直到叶面均匀布满雾滴为止，同样，于对照植株上喷施无菌水.将激素处理后的水稻幼苗置于光照培养箱中继续培养，温度为(25±1)℃，光照周期为12 h，湿度为75%.

1.2.5 表达分析 在喷施SA、JA后，于不同时间点(0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、60 h)取水稻叶片，并按Trizol试剂盒的说明书提取总RNA，同时按DNaseⅠ说明书消化其中残余的基因组DNA，然后取等量处理过的RNA并以其为模板进行cDNA的合成.PCR反应按以下条件进行:95℃ 4 min;95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共26个循环;72℃ 5 min.反应结束后于w=1%的琼脂糖凝胶上电泳检测.

2 结果与分析

2.1 水稻OsHUB1基因编码区的扩增 采用RT-PCR扩增水稻OsHUB1基因编码区全长cDNA，电泳检测结果见图1.在2 500～3 000 bp之间获得一条特异性的亮带，将该条带回收测序，结果显示该片段包含2 655个碱基对，是一个完整的开放阅读框，其编码产物为885个氨基酸的多肽，理论分子量为100.3 kD，理论等电点为7.785，属于碱性蛋白(见图2).

图1 OsHUB1基因的全长扩增

图2 OsHUB1核苷酸序列及其推测的氨基酸序列

2.2 OsHUB1的生物信息学分析 根据水稻数据库序列信息，通过网站http://www.softberry.com对OsHUB1基因结构进行在线分析，结果显示，OsHUB1基因全长7 803 bp，由18个内含子和17个外显子组成(如图3所示).通过http://smart.embl-heidelberg.de/help/smart_glossary.shtml网站对OsHUB1蛋白可能的结构域进行预测，结果表明，该蛋白C端有一高度保守的RING指结构域，N端存在一个低复杂度区域(Low compositional complexity regions，LCRs)和一个Coiled-Coil区(如图4所示).

图3 OsHUB1基因结构示意图

图4 OsHUB1蛋白结构域分析

将OsHUB1蛋白氨基酸序列在Genebank中与已经发布的氨基酸序列进行BLAST比对，发现OsHUB1蛋白与短柄草(Brachypodium distachyon)、杨树(Populus tomentosa)、葡萄(Vitis vinifera)、大豆(Glycine max)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的E3泛素连接酶分别具有78%，68%，68%，67%和62%的同源性.这些HUB1同源蛋白的C端均含有一个保守的RING指结构域，其中Cys-Xxx2-Cys-Xxx9-39-Cys-Xxx1-3-His-Xxx2-3-Cys/His-Xxx2-Cys-Xxx4-48-Cys-Xxx2-Cys分子结构模式高度保守，为该类E3泛素连接酶表现连接活性所必不可少的，其中Xxx代表任一氨基酸(如图5所示).以上分析结果说明，所扩增的OsHUB1基因是水稻中的RING型E3泛素连接酶的同源基因.

图5 不同植物来源的HUB1蛋白与OsHUB1蛋白RING-finger结构域氨基酸序列的同源性比较

2.3 不同信号分子处理水稻后OsHUB1的表达变化 SA和JA是植物抗病信号转导中重要的信号分子［9-10］，它们所介导的植物抗病信号转导途径在植物防卫反应中发挥着关键的作用.为了探究水稻Os-HUB1基因与不同信号途径的关系，笔者分析了SA和JA处理水稻幼苗不同时间后OsHUB1基因的表达变化情况，结果如图6和图7所示.实验结果表明，在内参基因OsActin表达相同的条件下，SA处理水稻幼苗6 h时，OsHUB1基因的表达被明显诱导，24 h后有所下降(见图6);同样，用JA处理水稻幼苗6 h也能够明显诱导OsHUB1基因的表达(见图7).以上数据说明，OsHUB1基因对SA和JA都能够产生应答，它可能参与了水稻中的SA和JA介导的抗病信号途径.

图6 SA处理水稻幼苗对OsHUB1表达的影响

图7 JA处理水稻幼苗对OsHUB1表达的影响

3 讨论

本研究克隆了水稻HUB1的同源基因OsHUB1，其开放阅读框为2 655 bp，它编码一个具有885个氨基酸残基的多肽.氨基酸序列分析表明，该蛋白C端有一个典型的RING指结构域，属于RING型泛素E3连接酶.在拟南芥中的研究表明，HUB1参与了植物对腐生病原真菌的防卫反应，并主要通过SA和JA信号途径发挥作用［19］.本研究结果亦表明，水稻中SA和JA也可以诱导该基因的表达，这与拟南芥中的研究结果基本一致.但也可以看到，SA对OsHUB1基因表达的诱导作用在6 h和12 h时最强，之后明显下降，这暗示:尽管OsHUB1基因同时参与SA和JA介导的信号途径，但其依赖的上游信号组分并不相同.

从图5的比对结果来看，尽管不同物种来源的HUB1蛋白的同源性不高，如水稻OsHUBI与拟南芥AtHUB1的同源性仅为62%，但其中的RING结构域却十分保守.在生化功能方面，AtHUB1具有体外和体内的E3连接酶活性，可以特异性地催化组蛋白H2B的单泛素化修饰，其中的RING指结构域为单泛素化反应所必须.因此推测，水稻OsHUB1应该同样具有E3连接酶活性，能够对底物进行泛素化修饰.根据图4显示的结果，OsHUB1蛋白中除了RING指结构域外，还具有一个coiled-coil regions结构和一个N端的LCRs结构.LCRs是普遍存在于真核生物蛋白中的一种结构，与蛋白分子的分化有关，而且它在蛋白分子中的位置与其功能关系紧密.一般认为，位于蛋白端部的LCRs与蛋白的胁迫应答有关［20］，因此推测:OsHUB1可能在水稻的抗病性中发挥重要作用.coiled-coil regions结构往往与蛋白分子内高级结构的形成和蛋白分子间的相互作用有关［21］，这暗示水稻中可能存在OsHUB1的互作蛋白.根据 DHAWAN等人的研究，拟南芥HUB1基因的T-DNA插入突变体茎秆的表皮细胞壁与野生型相比明显变薄，过量表达HUB1基因的植株表皮细胞壁则比野生型的明显变厚，表明HUB1很可能通过改变细胞壁厚度来抵抗病原菌的侵染，这与植物通过细胞壁的物理屏障抵抗腐生病原真菌的抗病机制相符合.此外，研究发现，AtHUB1能够与转录介体复合物的一个亚基MED21发生相互作用，该亚基不仅能够增强植物抗病性，还对种子的胚胎发育具有重要的调节作用.同时还发现，AtHUB1和AtMED21都可以被几丁质诱导表达［19］，这暗示AtHUB1是协同AtMED21，并通过激活植物病原相关分子模式激发的免疫反应(Pathogen Associated Molecular Pattern triggered immunity，PTI)来调控植物对腐生病原真菌的抗病性.在对果蝇的研究中发现，不同的基因转录激活过程都需要转录介体复合物的参与，其中包括抗微生物多肽的表达［22］，因此普遍认为，当上游调节因子和染色质发生修饰时，MED21能够感受这些信号并将其传递给RNA聚合酶II来调控相关基因的表达.但是根据我们尚未发表的实验结果，水稻OsHUB1与OsMED21之间并不存在明显的相互作用(未发表数据)，这暗示水稻OsHUB1与拟南芥中同源基因的生物功能可能存在差异.因此，为了阐明水稻OsHUB1基因的生物学功能，需要通过构建该基因在水稻中的敲除(或敲减)突变体和过量表达突变体来做进一步的分析.

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