水杨酸钠对急性百草枯中毒大鼠肺损伤的作用研究

钱 洁，陆晓晔，朱长清，吕利雄

0 引 言

百草枯中毒所致的肺损伤又称为百草枯肺，早期以急性肺泡炎、急性呼吸窘迫综合征为主要临床表现，后期多出现广泛肺间质水肿及肺纤维化，是百草枯中毒的主要死因。由于缺乏特效解毒剂，百草枯中毒的病死率极高［1-3］。近期，Dinis-Oliveira等［4-6］采用水杨酸钠治疗百草枯中毒的研究为改善百草枯中毒预后带来了新希望，其研究均提示水杨酸钠及其衍生物有望成为能显著改善百草枯中毒预后的药物。本实验旨在对此进行验证，并进一步探讨不同剂量水杨酸钠对百草枯中毒大鼠肺的保护作用，观察水杨酸钠治疗百草枯大鼠后的生存率及肺病理变化。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠59只，10～12周，体重200～300 g，购自中国科学院上海实验动物中心斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号SCXK(沪)2007-0005，标准喂养(室温20～25℃，相对湿度50%～70%，人工照明12 h日夜交替，自由饮水，标准饲料)。主要试剂为百草枯(1，1-二甲基-4，4-联吡啶阳离子盐，纯度99%)、水杨酸钠(2-羟基苯甲酸单钠盐)均购自Sigma公司，试剂以0.9%无菌等渗盐水溶解稀释后用于腹腔注射。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 动物以随机数字法分为6组，正常对照组(给予等渗盐水腹腔注射，6只);水杨酸钠对照组(水杨酸钠300 mg/kg腹腔注射，6只);百草枯A组(给予百草枯25 mg/kg染毒，11只);百草枯B组(给予百草枯35 mg/kg染毒，12只);水杨酸钠A组［(百草枯25 mg/kg染毒，2 h后予水杨酸钠(200 mg/kg)，12只)］;水杨酸钠 B组［百草枯35 mg/kg染毒，2h后予水杨酸钠(300mg/kg)，12只］。百草枯、水杨酸钠均用等渗盐水溶解后以1 mL体积腹腔注射［3-4］。

1.2.2 标本采集与制备 摘取急性期死亡大鼠的肺，并用无菌等渗盐水溶液即时配制3%的戊巴比妥钠，对28 d存活大鼠进行腹腔麻醉后摘取肺，置于中性甲醛溶液固定，制备石蜡切片，行常规HE染色、Masson染色，光镜下观察。

1.3 统计学分析 采用SPSS18.0统计软件对数据进行分析，各组的生存率采用Kaplan-Meier生存曲线进行描述，组间28 d生存率采用Fisher精确概率检验，Log-rank法比较各组间生存曲线差异。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生存率 实验结果显示:正常对照组和水杨酸钠对照组全部存活，28 d生存率100%。百草枯A、B组和水杨酸钠A、B组28 d生存率分别为36%、50%、42%、50%。百草枯A、B组28 d生存率较正常对照组差异有统计学意义(P=0.035，P=0.050)。与百草枯A组生存曲线比较，水杨酸钠A组对百草枯鼠的生存期无明显改善，差异无统计学意义(P=1.000)，水杨酸钠B组与百草枯B组比较，生存期同样无明显改善，差异无统计学意义(P=1.000)。见图 1。

图1 百草枯组和水杨酸钠治疗组大鼠生存率曲线Figure 1 Survival curves of the paraquat-exposed and NaSAL-treated rats

2.2 一般状况观察 百草枯A、B组及水杨酸钠A、B组大鼠给药后1 d，即出现不同程度的毛发松散、眯眼、口唇紫绀、步态蹒跚、易捕捉等现象，中毒后2～5 d症状最重，动物濒死时出现深大呼吸、点头样呼吸或呼吸频率加快，并出现明显的全身紫绀;存活7 d以上的部分大鼠上述症状逐渐减轻。正常对照组和水杨酸钠对照组未见明显异常。

2.3 光镜观察 HE染色:正常对照组和水杨酸钠对照组大鼠的肺结构正常，肺泡壁无塌陷，肺泡内无渗出液、细胞浸润，无毛细血管扩张、充血等表现。百草枯组急性期(第4天)病变主要为严重的肺泡炎性改变。同期水杨酸钠A、B组的肺损伤病理学改变与百草枯A、B组相比无明显改善。Masson染色:存活的百草枯A、B组的肺组织病理表现为肺泡间质增宽，有大量染绿的胶原纤维增生沉积，部分肺泡腔萎缩消失。水杨酸钠A、B组的肺病理切片表现类似，纤维化程度较百草枯组无明显减轻。见图2。

图2 光镜下正常对照大鼠及百草枯25 mg/kg染毒大鼠肺组织病理学改变Figure 2 Histopathological changes of the lungs in the normal control and paraquat-exposed rats

3 讨 论

目前的研究表明，肺组织对百草枯的主动蓄积是导致肺损伤的首要因素。通过多胺转运系统，肺组织主动摄取并蓄积百草枯，导致百草枯在肺内能维持一段时间的恒定水平，浓度甚至可达血清浓度的10～90倍，由此启动了一系列相对不可逆的损伤反应，最终导致肺纤维化。Rocco等［4］的研究显示百草枯染毒大鼠肺内胶原纤维含量从第1周开始即有所增加，持续到观察终点第8周。Dinis-Oliveira等［5-7］指出，水杨酸钠的治疗作用主要是通过清除活性氧、抑制髓过氧化物酶、抑制前炎性因子、抑制血小板聚集等机制实现的。由此我们想到，水杨酸钠是否能减少百草枯在肺内的蓄积，通过遏制百草枯肺损伤的首要因素来发挥作用?答案是否定的。在Dinis-Oliveira等［3-5］的实验中，水杨酸钠治疗组96 h后肺中仍可测得百草枯，百草枯含量与百草枯染毒组无显著差异。由此可见，水杨酸钠的作用机制可能并不在于直接减少或延缓百草枯的吸收，而在于抑制了百草枯启动的损伤过程。

我们设想，通过增加水杨酸钠用量的方式来提高肺内药物作用浓度及时间可能会获得更好的疗效。然而，本研究中水杨酸钠A组并未获得相对较高的生存率及病理改善。尝试以更高剂量的百草枯(35 mg/kg)及水杨酸钠(300 mg/kg)来分离水杨酸钠的保护作用，同样没有取得预期的效果。我们的实验并没能重复获得Dinis-Oliveira等［3-5］的实验结果，水杨酸钠治疗后百草枯大鼠的生存率及病理结果无明显改善。百草枯染毒大鼠的个体差异可能是导致这一结果的重要原因。我们的实验观察到，各组大鼠的中位生存期为3～5 d，以急性期1周内死亡多见，而部分通过急性期的大鼠生存期均大于28d。组间存活大鼠的病理改变存在一定差异，个别百草枯大鼠肺损伤程度相对较轻，这种病理差异在既往的研究中也有多次报道。Ruiz等［8］的实验中有20%的百草枯大鼠未出现肺纤维化，这些“耐受”大鼠与其余肺纤维化大鼠相比，胶原酶、基质金属蛋白酶及其组织抑制物的表达有差异，这种差异可能与肺纤维化的产生相关。Satomi等［9］认为部分“耐受”大鼠未出现纤维化的原因可能与具有降解胶原蛋白的能力相关。

百草枯大鼠的预后存在个体差异，这种差异与百草枯中毒后引起不同个体的基因表达差异相关。Satomi等［10］运用基因芯片技术，发现百草枯大鼠与正常对照大鼠之间存在108个基因的表达差异，同时观察到部分百草枯大鼠中存在36种差异表达的基因，这导致了百草枯中毒大鼠预后的差异。

百草枯是人类致死率最高的农药之一，同时百草枯毒性存在种族间差异［11］，目前全球百草枯管理进入误区，正是转化医学发展的源动力［12］。权威机构所引用的百草枯半数致死量研究数据，本身存在两大问题:观察期太短和样本量小。但基于动物福利和人道保护考虑，并遵循动物研究3R原则，欧洲经济合作组织推出的新急性毒性半数致死量测定方法，目前已经得到美国、中国等管理机构采纳，这使得百草枯半数致死量研究限入困境，如固定剂量法每次只许用1只动物［13-15］。本研究动物数量虽然采用原研究方案，但百草枯生存率研究中样本量问题没有解决，俞爱青［16］和 Huang 等［17］的重复研究也未能得出原有结果。

我们将进一步探寻与百草枯中毒肺损伤相关的基因表达，明确影响基因表达的因素，并进一步从分子和基因水平为水杨酸钠对百草枯中毒的作用寻找依据，可能是今后研究的方向。

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