夹闭腹主动脉和腰动脉的脊髓缺血再灌注损伤模型比较研究

张 俐，安国尧，陈 凯，李长征，张文光

0 引 言

脊髓缺血再灌注损伤可致神经功能障碍甚至瘫痪，其发病率呈逐年上升趋势［1－2］，目前仍为世界难题［3－4］。已有的模型制作方法有夹闭法、血流阻断法、栓塞法等［5］，但使用最多的仍然是夹闭腹主动脉法。Zivin［6］采用分离腹主动脉至肾动脉水平，于左肾动脉根部上方用Scoville-Lewis动脉夹夹闭腹主动脉，暂时关闭腹腔造成脊髓缺血，阻断血流60min后打开腹腔，松开动脉夹恢复血流，制成传统脊髓缺血再灌注损伤模型。Herlambang等［7］采用肾动脉和主动脉之间夹闭腹主动脉，Kim等［8］采用夹闭腹主动脉及其分支制作 SCI鼠模型，Wang等［9］、管玉龙等［10］采用夹闭胸主动脉制成脊髓缺血再灌注损伤模型，但前期的研究发现，夹闭胸、腹主动脉会导致夹闭部位以下的组织缺血，如脊髓、肠、肾等组织缺血后，会产生炎性因子，这些炎性因子进入脊髓组织后会在原有损伤的基础上再次加重脊髓的损伤［11－12］。所以，寻求稳定性好、重复性高、操作性强，既能造成相应节段脊髓组织缺血，又对夹闭部位以下损伤较小、并发症少的动物模型极其重要。本实验通过夹闭腹主动脉和腰动脉2种方法制作脊髓缺血再灌注损伤模型，应用数字减影技术鉴定，对比分析，确定最符合临床脊髓缺血再灌注损伤的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料 新西兰家兔12只(动物合格证号:2007001100989)，雌雄不限，3月龄，体重(2.0±0.2)kg，上海生旺实验动物养殖有限公司提供，许可证号:SCXK(沪)2007－0011，饲养环境及饮食均符合动物饲养标准，实验动物处置符合伦理学标准。

1.2 主要仪器与试剂 SIEMENS数字减影仪(型号:SIEMENS MULTISTER-TOP)、倒置生物显微镜(Olympus BX51，Japan)、义齿基托树脂Ⅱ型(自凝牙托粉)(A)、义齿基托树脂液Ⅱ型(自凝牙托水)(B)、邻苯二甲酸二乙酯(C)、油画染料(D)、硫化钠、盐酸、氯胺酮、速眠新、造影剂等。

1.3 实验方法

1.3.1 家兔血管铸型标本的制作 按 A∶B∶C=4∶5∶2的比例配制铸型剂。硫化钠8 g加入100 mL的水配制成脱毛剂。造影剂与等渗盐水等量稀释。

家兔2只禁食称重，从胸骨角至腹部脱毛，冲洗，并用75%乙醇擦洗 3次。按氯胺酮 0.8 mL/kg［13］、速眠新 0.2mL/kg［14］行肌内注射麻醉。麻醉成功后，消毒，沿前正中线打开胸腔，充分暴露心脏及升主动脉，在心脏与升主动脉之间剪断，用等渗盐水冲洗至术野清晰为止。用4.0手术线将带有橡胶管的玻璃套管固定在血管断口内，然后沿玻璃套管注入铸型剂。待试剂凝固后，将家兔腹部皮肤稍稍划开，放入盐酸池中腐蚀。腐蚀完毕，按照杨成杰等［15］介绍的标本制作技术，制作标本，观察、分析家兔的血管分布并拍照。

1.3.2 建立家兔脊髓缺血再灌注损伤模型 方法同前，家兔10只称重后按随机数表法分为夹闭腰动脉组、夹闭腹主动脉组。麻醉，仰卧，沿剑突至耻骨联合处脱毛，常规消毒，在剑突至耻骨联合偏左侧处，逐层切开，夹闭腰动脉组家兔钝性分离并充分暴露腹主动脉，找出左肾动脉，于左肾动脉下端分离出L3－6，用Scoville-Lewis动脉夹夹闭腰动脉，造成脊髓相应节段缺血，暂时关闭腹腔造成脊髓相应节段缺血，并在切口处覆盖等渗盐水纱布，30 min后打开腹腔，松开动脉夹使血流恢复，制成脊髓缺血再灌注损伤模型;夹闭腹主动脉组家兔钝性分离并充分暴露腹主动脉，于右肾动脉上方夹闭腹主动脉，同上，制成脊髓缺血再灌注损伤模型。

1.3.3 数字减影技术鉴定脊髓缺血再灌注模型

模型制作好后采用数字减影血管造影技术鉴定该模型。沿腹主动脉给家兔血管中灌注造影剂后，用数字减影心血管机拍摄在夹闭期间未注入造影剂、夹闭期间注入造影剂、动脉再灌注时3个时间段脊髓血供的影像，并进行对比分析。确定脊髓缺血完全，并镜下摄像，以鉴定模型成立。保持通风，室温22℃。

1.3.4 HE染色鉴定2种模型脊髓组织中神经元细胞的损伤情况 将鉴定成功的2种脊髓缺血再灌注损伤模型的家兔脊髓组织取出浸泡在4%多聚甲醛之中，24 h后对其进行脱水、石蜡包埋，将包埋好的蜡块置入切片机，调节切片厚度为6 μm，切取蜡带，挑选组织形态完整的蜡带贴于防脱玻片上，放入60℃恒温箱烤片1 h，室温下冷却5 min，按照以下步骤脱蜡复水:二甲苯Ⅰ15 min、二甲苯Ⅱ15 min、100%乙醇Ⅰ10 min、100%乙醇Ⅱ10 min、90%乙醇10 min、70% 乙醇 10 min、50% 乙醇 10 min、双蒸水5 min，接着将玻片浸入苏木精染液中(即进即出)，再放入1%盐酸乙醇分化2～3 s后，放入伊红染液中1 min，再将玻片放入双蒸水、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ各5 min、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10 min，中性树胶封固，显微镜拍片。分析对比图片，以确定最佳的脊髓缺血再灌注损伤模型。

2 结 果

本实验的12只家兔均进入结果分析，无脱落现象。

2.1 血管铸型的结果 家兔铸型标本的血管成型饱满、疏密有度，能充分显示家兔动脉血管及其走行，其中腰动脉、腹主动脉、左右肾动脉、肠系膜下动脉、等血管得到完整清晰的显示。见图1。

图1 家兔血管铸型标本中腰动脉完整铸型Figure 1 Complete casting specimen of the lumbar arteries the rabbit

2.2 数字减影技术鉴定脊髓缺血再灌注模型 随造影剂打入，各个部位的血管能逐步显示出来。图2分别为阻断腰动脉未注入造影剂、阻断腰动脉期间注入造影剂、去除阻断注入造影剂3个时段所成的图像。由图2可见，阻断腰动脉时，造影剂到达阻断部位以后不能通过夹闭部位，当再次打开血管夹时，造影剂能再次进入被阻断后的血管;图3分别为阻断腹主动脉未注入造影剂、阻断腹主动脉注入造影剂、去除阻断注入造影剂所成图像。由图3可见，阻断腹主动脉时，造影剂到达阻断部位以后不能通过夹闭部位，当打开血管夹时，造影剂能进入被阻断后的血管。

图2 数字减影技术鉴定阻断腰动脉脊髓缺血再灌注的血供影像Figure 2 Blood supply in the spinal cord ischemia/reperfusion model by blocking the lumbar artery identified by DSA

图3 数字减影技术鉴定阻断腹主动脉脊髓缺血再灌注的血供影像Figure 3 Blood supply in the spinal cord ischemia/reperfusion model by blocking the abdominal aorta identified by DSA

2.3 夹闭腹主动脉及腰动脉脊髓组织HE染色结果通过HE染色对比可见，夹闭腹主动脉组脊髓组织明显水肿、疏松，神经细胞肿胀明显，神经元间隙增大，有空泡形成，神经元胞体呈三角形并数量增多，胞核固缩偏位、碎裂溶解，核仁消失，细胞质不均并嗜伊红染色，白质呈疏网状改变，见图4。夹闭腰动脉组脊髓组织神经元损伤较夹闭腹主动脉组小，见图5。

图4 夹闭腹主动脉脊髓组织(HE×400)Figure 4 Spinal cord tissue after blocking the abdominal aorta(HE×400)

图5 夹闭腰动脉脊髓组织(HE×400)Figure 5 Spinal cord tissue after blocking the lumbar arteries(HE×400)

3 讨 论

理想的脊髓缺血再灌注损伤模型应具备以下特点:①所建立动物模型的损伤过程及伤后病理生理改变同人类脊髓缺血再灌注损伤尽可能相类似。②操作简便，重复性好。本研究在Zivin传统方法基础上进行了一系列改良:首先实验动物上选择了来源丰富、体积较大的家兔［16］。Zivin法选择于左肾动脉根部近端阻断腹主动脉，并未提供足够的依据。本实验通过制作家兔动脉铸型标本及数字减影摄片，发现于左肾动脉下方阻断腰动脉能造成大部分腰段脊髓缺血。脊髓缺血时间的控制对筛选最佳的动物模型至关重要，早期的学者认为，缺血时间在17～60 min内较为合适［17］。研究显示，脊髓组织在一定时间内(30 min)恢复血供，神经元的功能可以得到恢复，如果超过这个时间范围，神经元将发生不可逆的损伤［18－19］。传统 Zivin法阻断腹主动脉60 min，我们通过实验发现，在常温下于左肾或右肾动脉起始部近心端阻断腹主动脉60 min，将造成家兔脊髓神经不可逆损伤，不利于观察药物对神经功能的影响。故本实验采用的阻断时间为30 min。

有研究表明:阻断腹主动脉将同时造成腹、盆腔脏器缺血再灌注损伤，并发症多［20－21］。由于小型实验动物的腰动脉管径小，不易寻找，甚至可能误扎其他血管，故本实验选择体积较大型的新西兰家兔［22－23］。本实验采用血管铸型技术详细地分析家兔脊髓组织的血管走形，夹闭腰动脉(L3－6)和腹主动脉制成脊髓缺血再灌注损伤模型后采用数字减影血管造影技术鉴定并分析比较，通过HE染色可见，夹闭腹主动脉组脊髓组织明显水肿、疏松，神经细胞肿胀明显，神经元间隙增大，有空泡形成，神经元胞体呈三角形并数量增多，胞核固缩偏位、碎裂溶解，核仁消失，胞质不均并嗜伊红染色，白质呈疏网状改变，而夹闭腰动脉组脊髓组织神经元损伤较前者小。我们推测可能还有肠、肾等缺血的炎性因子导致神经元的二次损害，因此神经元细胞损害较大而且较多。

综上所述，通过上述2种方法均能导致相应脊髓节段完全缺血，均可成功建立家兔脊髓缺血再灌注损伤模型，阻断腹主动脉或胸主动脉会造成阻断平面以下肌肉组织的大面积缺血，而阻断腰动脉模型主要是阻断脊髓血供及周围少部分肌肉的血供，所以，阻断腰动脉的造模方法优于阻断腹主动脉的造模方式，并发症少，克服了传统模型的缺陷，安全可靠，操作简单，重复性好，更贴近临床脊髓缺血再灌注损伤的病因与病理机制，使脊髓缺血再灌注损伤模型的建立更加具有说服力。

血管铸型技术是解剖学标本制作的一项专门技术［24］，是一种直观观察血管分布的解剖方法。目前该技术主要用于血管分布状况及微血管的检测［25－26］。而数字减影技术是一种常规血管造影术和电子计算机图像处理技术结合的X线成像系统，结合了常规血管造影术和电子计算机图像处理技术，目前主要应用于血管性疾病的诊断和治疗［27－29］。

血管铸型标本的影响因素诸多。为更好地完成血管铸型，首先，在暴露心脏时，动作要轻柔，注意不要剪伤周围的动脉血管，以免加注铸型剂时液体外漏。其次，插玻璃导管时应选取升主动脉近心端，用4.0手术线结扎，使玻璃管牢固的固定在升主动脉中，同时注意玻璃管尖端勿刺破血管、缝合线结扎时力度要适宜，防止缝合线割断血管。第三，灌注铸型剂时，用注射器接在玻璃管口回抽无液体被吸出时加入铸型剂，灌注时所用的压力和剂量要适当，防止压力过大造成铸型剂外漏和血管破裂。第四，将灌注好铸型剂的标本放入盐酸池中时，要将家兔摆好体位，并将家兔腹部及背部的皮肤剪开，以便盐酸能更好的进入标本进行腐蚀。标本制作好后，修整标本时要注意保护标本，以免血管铸型标本被折断［30］。

在数字减影过程中，需注意以下因素:首先，要确保穿刺针进入血管，并固定牢固，防止穿刺针刺破血管导致造影剂外漏影响图像采集;其次，最好应选择孔径较小且橡胶材质的穿刺针;第三，在造影剂注入前及造影剂注入血管的全程采集图像;第四，为了得到较好的图像，尽快开胸并沿升主动脉注入造影剂;第五，注入造影剂要足量。在数字减影图像中，我们可以明显的看到，夹闭时腰动脉组造影剂无法从腰动脉进入脊髓组织，当再次打开血管夹时，造影剂就可以进入脊髓组织。这样通过血管铸型明确了家兔脊髓组织的血液供应血管走行情况，找到了为脊髓组织供应血液的动脉血管以及血管的走行;通过数字减影技术鉴定了缺血再灌注模型，通过夹闭动脉未注入造影剂、夹闭动脉后注入造影剂以及解除阻断动脉再灌注3个时间点的对比得知，夹闭动脉之后，造影剂无法通过夹闭部位，夹闭位置以下的血管不能显影，当我们打开血管夹时，造影剂可以通过血管。

夹闭腰动脉制作脊髓缺血再灌注损伤模型很好的模拟了临床上脊髓缺血再灌注损伤的特征，避免了传统脊髓缺血性动物模型的并发症，是一个理想的动物模型，可以推广使用。通过夹闭腰动脉制成的脊髓缺血再灌注损伤模型为今后脊髓缺血再灌注损伤治疗及机制探讨提供一个全新的平台。

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