冠心病猝死者心肌细胞CARP和CaMKⅡ的表达

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(青岛大学医学院附属青岛市市立医院，山东 青岛 266011； 1 病理科; 2 心内科)

冠心病猝死者心肌细胞CARP和CaMKⅡ的表达

崔啟春1，杨彦华1，于建宪1，张七一2，丁华民2

(青岛大学医学院附属青岛市市立医院，山东 青岛 266011； 1 病理科; 2 心内科)

目的了解冠心病猝死(SCD)者心肌组织中心锚重复蛋白(CARP)及钙离子依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表达,并探讨其法医学意义。方法收集30例SCD尸检心肌组织为实验组，30例非SCD尸检心肌组织为对照组，应用免疫组织化学方法检测两组标本中CARP和CAMKⅡ的表达。结果实验组CARP和CaMKⅡ表达明显高于对照组,差异有显著性(Z=-6.706、-7.018，P<0.01)。实验组中CARP表达与CaMKⅡ表达呈正相关(r=0.833，P<0.01)。结论SCD者心肌细胞中CARP和CaMKⅡ的表达升高可能与SCD的发病相关，可以为法医鉴定SCD提供重要证据。

法医学；猝死，心脏；免疫组织化学；心锚重复蛋白；钙离子依赖性蛋白激酶Ⅱ

世界卫生组织将心源性猝死定义为各种心脏原因所致的突然死亡，病人在原有心脏疾病基础上发生急骤的变化后24 h内死亡，坏死心肌组织于发病6 h后发生明显改变[1]。心源性猝死者既往可伴有心脏疾病但是死亡的时间和模式是不可预测的[2]。美国冠心病猝死(SCD)发病率为(100～200)/10万，每年有33.5万～35.0万人死于SCD，我国每年心源性猝死人数达120万，其中80%为SCD[3]。对于SCD发病机制的深入研究和寻找有效的检查方法是人们迫切需要解决的问题。相关研究结果显示，心锚重复蛋白(CARP)和钙离子依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)通过激活血管生成递质或作为病理信号传导通路中的一员参与心肌损伤修复过程。直接应用人体标本检测并研究两者共同表达及相关性鲜有报道[4]。本研究应用免疫组化方法，检测CARP和CaMKⅡ在SCD者心肌组织中的表达，并探讨其在法医病理学中的应用及意义。

1 材料和方法

1.1标本及其来源

查询2011—2013年我院病理科尸检记录，结合临床及病理学资料选取诊断为SCD者的尸检心肌组织蜡块标本共30例作为实验组，男17例，女13例；年龄38～76岁，平均48.2岁；均于发病后24 h内死亡，其中6 h内死亡5例，12 h内死亡18例，全部病例均在死后48 h内经全面系统尸检证实其冠状动脉主要分支中至少一支病变程度达Ⅲ级或Ⅳ级，且能排除其他可能导致猝死疾病。同时，选取非SCD尸检心肌组织蜡块标本30例作为对照组，其中肺动脉栓塞所致猝死者6例，病毒性心肌炎所致猝死者3例，扩张型心肌病所致猝死者2例，失血性休克、机械性窒息、交通事故、脑挫裂伤等非心源性猝死者19例；男21例，女9例；年龄18～77岁，平

均40.8岁。对照组所有病例尸检均证实无冠状动脉病变或仅有Ⅰ级轻度病变。

1.2主要试剂

兔抗人CARP多克隆抗体(bs-8074R，浓缩型)和兔抗人CaMKⅡ多克隆抗体(bs-9921R，浓缩型)，北京博奥森生物技术有限公司生产；即用型快速免疫组化MaxVision检测试剂盒、DAB显色试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术开发公司。

1.3实验方法

1.3.1组织形态学观察 按常规方法进行苏木精-伊红(HE)染色,显微镜下观察两组标本组织形态学特征。

1.3.2CARP和CaMKⅡ表达检测 采用免疫组织化学染色法，应用即用型快速免疫组化Max Vision检测试剂盒、DAB显色试剂盒进行检测，按试剂盒说明书操作。CARP需用0.01 mmol/L、pH 6.0枸橼酸钠缓冲液进行高压修复，CaMKⅡ需用pH 9.0的EDTA抗原修复液进行修复。CARP和CaMKⅡ抗体稀释度为1∶100。CARP和CaMKⅡ均用已知的乳癌切片作为阳性对照，用与一抗同种兔的非免疫血清代替一抗作为阴性对照。

1.4免疫组化结果判断

CARP阳性染色定位于胞浆内，着色程度深浅不一，呈片状、灶状或弥漫分布，细胞核有少量表达。CaMKⅡ阳性染色为胞浆内大部分区域呈现弥漫性棕黄色颗粒。参照文献[5]标准，将染色深浅与背景着色相对比后，先进行染色强度计分：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；再进行阳性细胞所占百分比计分：阴性细胞0分，阳性细胞≤25%计为1分，阳性细胞26%～50%计为2分，阳性细胞51%～75%计为3分，阳性细胞>75%计为4分。根据染色强度计分与阳性百分比计分之和判定结果：0～1分为(-)，2～3分为(+)，4～5分为()，6～7分为()，其中()判为弱阳性，()判为阳性。大片出血坏死区域、受挤压组织及切片边缘不计入阳性成分判断。

1.5统计学方法

应用SPSS 18.0软件进行数据处理，数据间比较采用秩和检验，相关性采用Spearman相关分析。

2 结 果

2.1两组标本HE染色结果比较

实验组部分病例心肌组织镜下可见大面积心肌组织纤维断裂，组织间质水肿，另有部分心肌细胞出现空泡变性，肌原纤维及细胞核溶解消失；部分心肌梗死区域表现为凝固性坏死，心肌细胞胞浆嗜伊红性增高，核消失；梗死灶边缘可见充血带及中性粒细胞浸润，心肌细胞肿胀，胞浆内出现颗粒状物及不规则横带；冠状动脉左前降支、左旋支、右冠状动脉管腔狭窄，程度均>50%,部分管腔畸形、内膜增厚，纤维结缔组织增多，其中5例可见管腔内血栓形成，血栓内见大量无定形坏死物、胆固醇结晶及少量泡沫细胞。对照组中有3例见散在心肌组织纤维部分区域断裂，心肌组织细胞轻度水肿，点状嗜伊红增强；冠状动脉左前降支、左旋支、右冠状动脉管腔无病变或略狭窄，程度均<25%。

2.2两组CARP和CaMKⅡ表达比较

实验组中有23例胞浆内出现棕黄色CARP阳性表达；对照组仅有4例心肌组织胞浆内见CARP弱阳性表达,其余均为阴性。实验组中有25例胞浆内出现棕黄色CaMKⅡ阳性表达；对照组仅有3例胞浆内见CaMKⅡ弱阳性表达，余为阴性。实验组与对照组CARP与CaMKⅡ表达比较，差异有显著性(Z=-6.706、-7.018，P<0.01)。见表1。

表1 两组CARP及CaMKⅡ表达比较(n=30,例)

2.3SCD心肌组织CARP与CaMKⅡ表达相关性

SCD心肌组织中CARP与CaMKⅡ表达呈正相关(r=0.833，P<0.01)。

3 讨 论

法医检案工作中常会遇到猝死案例，其中又以SCD最为常见，在SCD心肌中找到一种能在法医实际检案中具有一定特异性及稳定性的形态学指标将为法医病理学工作者提供极大的帮助。

CARP是一种主要在心脏表达的核蛋白，在血管新生内皮细胞、上皮细胞、乳癌细胞中均有少量表达[6]。CARP在心脏发育过程中及心血管细胞受损、缺血性心肌病中表达均上调。影响CARP表达的主要因素有：各种可以导致氧化应激的因素(阿霉素、低氧血症、缺血再灌注等)、β-肾上腺素受体激动剂、蛋白激酶A及CaMK、心肌组织损伤、血管紧张素Ⅱ、白细胞介素-1、单核细胞趋化因子等[7-8]。以往研究证实，CARP具有诱导血管新生、调节细胞凋亡以及参与心肌结构和功能的调节[9]。本文HE染色结果显示，实验组标本冠状动脉血管内膜损伤较对照组严重，部分病例有冠状动脉血栓形成，心肌组织缺血低氧及再灌注损伤均较为严重；免疫组化研究结果表明，实验组心肌组织中CARP的表达较对照组显著升高，提示CARP可能作为已知血管生成因素中有关信号转导途径中的一员，成为新血管生成内在机制的组成部分，其可能对血管生成激活物的抑制剂有阻遏作用，或者激活一类血管生成递质，例如VEGF、FIK-1或Ang-Ⅰ等。近来研究显示，CARP 表达不仅定位于细胞核中，在心肌细胞、肌小节Ⅰ区中也有表达，在肌小节Ⅰ区CARP 与肌小节蛋白特定的氨基端结合为肌靶蛋白[10]，肌靶蛋白氨基端在心肌细胞中表达过度导致肌小节结构被破坏，因此，肌靶蛋白与CARP 的相互作用需要保持肌小节的完整性[10]。本文实验结果显示，CARP阳性表达部位位于胞浆中，且肌小节断裂处及细胞连接处表达量明显增多。推测在心肌损坏的肌纤维中CARP 可能被诱导表达过度。CARP在细胞中分布和表达的异常导致其成为组织修复研究的新靶点。

对于SCD的认识，有观点认为Ca2+和CaMKⅡ的激活导致心肌细胞功能紊乱及细胞膜电生理不稳定，CaMKⅡ的激活伴随着细胞内Ca2+增多及氧化，被激活的CaMKⅡ参与组成病变的信号传导通路，催化磷酸化一系列对细胞ECC和细胞生存至关重要的靶蛋白，包括离子通道中Ca2+平衡蛋白、转录因子和导致心肌肥厚和炎症的基因表达，这些丰富多样的靶蛋白可以帮助解释CaMKⅡ对心肌细胞机械及电生理功能潜在的影响。CaMKⅡ的激活被认为是导致心力衰竭、心律失常及心源性猝死众多病理信号传导通路中的关键部分。本文结果显示，CaMKⅡ在受损细胞胞浆中表达为阳性，考虑为心肌细胞缺血再灌注损伤引起Ca2+外流导致CaMKⅡ被激活；与对照组比较，实验组损伤心肌细胞中CaMKⅡ高表达。再次证实CaMKⅡ的激活可能引发心肌细胞电生理紊乱，CaMKⅡ表达及活性增加导致心肌梗死后心力衰竭及SCD的发生[11]。因此，可以推测CaMKⅡ在心肌中被激活是导致冠心病心肌梗死后猝死过程中的重要环节。

本研究应用免疫组织化学法观察人体心肌组织CARP和CaMKⅡ的表达，结果显示，实验组心肌细胞中23例CARP表达阳性，对照组仅有4例CARP表达为弱阳性(其中1例为病毒性心肌炎猝死，1例为扩张型心肌病猝死，2例为机械性窒息猝死)；实验组心肌细胞胞浆中25例CaMKⅡ表达为阳性，对照组有3例表达为弱阳性(其中2例为肺栓塞猝死，1例为扩张型心肌病猝死)，两组CARP和CaMKⅡ表达差异有显著性，且二者呈明显正相关。对于本研究中实验组部分病例出现CARP和CaMKⅡ阴性表达及对照组部分病例出现弱阳性表达，原因可能与取材定位不准确，标本固定不及时造成自溶、抗原丢失以及背景着色干扰判断等因素有关。本文研究结果提示，CARP和CaMKⅡ表达的增高与SCD的发生有一定的相关性，二者在SCD发病的病理生理过程中发挥了一定的作用。本研究缺少实验组内CARP、CaMKⅡ阳性表达强度与死亡时间及病变程度的相关性分析，以后工作中我们将收集更多SCD标本，完善相关数据，对研究结果做出更加全面系统的分析。

综上所述，应用免疫组化法观察猝死者心肌组织CARP和CaMKⅡ表达情况，可以为法医病理工作者鉴别诊断SCD提供帮助，具有一定的实际意义。此外，联合检测CARP和CaMKⅡ在SCD高危人群血液中的表达情况，可能为SCD高危人群干预及治疗提供帮助。

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(本文编辑 黄建乡)

EXPRESSIONSOFCARDIACANKYRINREPEATPROTEINANDCALCIUMDEPENDENTPROTEINKINASEⅡINPATIENTSSUDDENDEATHOFCORONARYHEARTDISEASES

CUIQichun,YANGYanhua,YUJianxian,ZHANGQiyi,DINGHuamin

(Department of Pathology, The Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266011, China)

ObjectiveTo understand the expressions of cardiac ankyrin repeat protein (CARP) and calcium dependent protein kinase Ⅱ (CaMKⅡ) in myocardial tissue of patients sudden death of coronary heart diseases (CHD), and explore its signi-ficance in forensic medicine.MethodsMyocardial tissues collected from autopsy in 30 cases of sudden cardiac death (SCD) served as experimental group, and 30 of non-SCD served as control group, the expressions of CARP and CaMKⅡ in samples of the two groups were detected by immunohistochemistry.ResultsThe expressions of CARP and CaMKⅡ in myocardium of the experimental group were higher than that of the control (Z=-6.706,-7.018;P<0.01), and the expressions between CARP and CaMKⅡ were positively correlated (r=0.833,P<0.01).ConclusionThe elevation of expressions of CARP and CaMKⅡ in SCD patients’ heart muscle cells is likely to associate with the development of the condition, which may provide an important evidence for medicolegal expertise.

forensic medicine; sudden death, cardiac; immunohistchemistry; cardiac ankyrin repeat protein; calcium dependent protein kinase Ⅱ

2013-10-13;

2014-03-31

青岛市科技发展计划立项项目(13-1-4-129-jch)

崔啟春(1984-)，男，在读硕士研究生。

于建宪(1954-)，男，主任医师，硕士生导师。

R892.1

A

1008-0341(2014)03-0225-04