氨磷汀对荷瘤鼠放疗后肿瘤保护作用

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(青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003)

氨磷汀对荷瘤鼠放疗后肿瘤保护作用

牟俊俊，安永恒

(青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003)

目的探讨氨磷汀对C57BL/6荷瘤鼠放疗后肿瘤组织的保护作用及其对放疗效果的影响。方法培养Lewis肺癌细胞株，传代，制成单细胞悬液，调整细胞密度至106/L，小鼠右下肢皮下注射制备荷瘤鼠模型。随机分为放疗+氨磷汀组(A组)、放疗组(B组)、氨磷汀组(C组)、对照组(D组),各8只。放疗前给予A组、C组荷瘤鼠腹腔注射5 mL氨磷汀溶液(8 g/L)，B组、D组给予同等剂量生理盐水腹腔注射，30 min后A组、B组荷瘤鼠局部照射6 MV的X线10 Gy。每2 d测量小鼠体质量及肿瘤体积；15 d后处死小鼠，TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率。结果A、B、C、D组小鼠各时间点体质量差异均无显著意义(P>0.05)。第1天4组荷瘤鼠肿瘤体积比较差异无显著意义(P>0.05)，第3～13天A组肿瘤体积较其他3组减小，B组肿瘤体积较C、D组减小，差异有显著意义(F=4.290～15.470，P<0.05)；A组与B组比较、C组与D组比较，差异无显著意义(P>0.05)。A组肿瘤细胞凋亡率高于其他3组，B、C组高于D组，差异均有显著意义(F=36.535,P<0.01)；B组、C组比较，差异无显著意义(P>0.05)。结论氨磷汀对肿瘤组织没有明显的保护作用，不影响放疗效果；氨磷汀可能具有促进肿瘤细胞凋亡的作用。

氨磷汀；放射疗法；免疫组织化学；细胞凋亡

放射治疗是恶性肿瘤的重要治疗手段，放疗的副作用常常导致治疗终止，影响病人预后。细胞保护剂能减轻放疗副作用，其最理想的效应是能够减轻肿瘤治疗中的毒性反应和副作用，不影响肿瘤的治疗效果[1-2]。大量研究结果证明，细胞保护剂氨磷

汀能够明显减轻放化疗引起的多种组织的早期和晚期损伤，包括心脏、肠道细胞、肺组织、腺体、骨组织等[3-5]，使病人治疗过程中耐受程度大大提高，从而确保了治疗的完成。但是氨磷汀保护正常组织的同时对肿瘤细胞是否同样具有保护作用，其对放疗效果是否具有一定程度的削弱作用，目前仍是本专业领域所顾虑的问题。本文观察氨磷汀对放疗过程中的肿瘤组织是否具有保护作用，以期对临床合理应用此药提供实验参考。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1主要材料

Lewis肺癌细胞株，购自青岛大学医学院附属医院中心实验室；C57BL/6小鼠32只，雄性，6～8周龄，体质量18～20 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；氨磷汀(每支400 mg，大连美罗大药厂生产)，以生理盐水稀释至8 g/L；DMEM高糖培养液(Hyclone公司)；澳洲源胎牛血清，青霉素-链霉素双抗(Hyclone公司)；TUNEL细胞凋亡试剂盒(美国罗氏公司)；美国Varian公司直线加速器(我院肿瘤放疗科提供)。

1.2Lewis肺癌细胞株的培养及动物模型制备

将Lewis肺癌细胞株以含体积分数0.10胎牛血清、体积分数0.01青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养液培养，每1～2 d换液一次。显微镜下观察细胞生长状况，待细胞贴壁面积达80%左右时进行传代。调整Lewis肺癌单细胞悬液密度为106/L，每只小鼠右下肢皮下注射0.2 mL，2～3 d后可见肿瘤生长[6]，成瘤率为100%，荷瘤鼠模型制备成功。饲养1周后荷瘤鼠即可用于实验。

1.3实验分组及处理

将荷瘤鼠随机分为放疗+氨磷汀组(A组)、放疗组(B组)、氨磷汀组(C组)、对照组(D组)，每组8只。A组、C组小鼠均腹腔注射8 g/L的氨磷汀溶液5 mL，B组、D组给予等体积生理盐水腹腔注射。30 min后，A组、B组小鼠水合氯醛全麻后固定，右下肢肿瘤区局部给予6 MV的X线源皮距照射，源皮距=100 cm，深度=3 cm，加 1 cm组织补偿，剂量(DT)=10 Gy。

1.4观察指标及方法

照射后每2 d测量各组小鼠的体质量、肿瘤最长径(a)和最短径(b)，共测量7次，计算肿瘤体积(V)：V=ab2π/6。并于15 d后脱颈椎法处死荷瘤鼠，完整剥取肿瘤组织，石蜡包埋、切片后，TUNEL法测肿瘤细胞凋亡率。

1.5统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组荷瘤鼠体质量比较

A、B、C、D组间各时间点荷瘤鼠体质量比较，差异均无统计学意义(F=0.775～2.284，P>0.05)。A组、B组小鼠体质量先减少后增加，差异有显著性(F=2.734、5.517，P<0.05)；C组、D组小鼠体质量逐渐增加，差异有显著性(F=5.517、12.062，P<0.05)。见表1。

2.2各组荷瘤鼠肿瘤体积比较

第1天4组荷瘤鼠肿瘤体积差异无显著意义(F=1.201，P>0.05)，第3～13天A组肿瘤体积较其他3组减小，B组肿瘤体积较C、D组减小，差异均有显著性(F=4.290～15.470，P<0.05);A、B组比较，C、D组比较，差异无显著性(P>0.05)。A组肿瘤体积第9天达到最大值，B组、C组肿瘤体积第13天达到最大值，D组肿瘤体积第5天达到最大值，差异均有显著性(F=3.267～10.814，P<0.01)。见表2。

2.3各组肿瘤细胞凋亡率比较

A组肿瘤细胞凋亡率为0.065 7±0.010 9，B组为0.045 8±0.086 9，C组为0.043 4±0.006 0，D组为0.022 4±0.006 6。A组肿瘤细胞凋亡率高于其他3组，B、C组高于D组，差异均有显著性(F=36.535,P<0.01)；B组、C组比较，差异无显著性(P>0.05)。各组肿瘤细胞TUNEL染色结果见图1。

表1 各组荷瘤鼠体质量比较

表2 各组荷瘤鼠不同时间肿瘤体积比较

A：A组，B：B组，C：C组：D：D组。TUNEL染色，400倍。

3 讨 论

氨磷汀是半胱氨酸硫磷酸盐，本身无活性，它在体内被碱性磷酸酶水解脱磷酸转化成有活性的代谢产物——含自由巯基的WR-1065，通过清除放射线所产生的自由基并且提供DNA损伤修复所需要的氢离子，从而发挥细胞保护作用[7-10]。氨磷汀是目前临床上较为公认的细胞保护剂，一定程度上可减轻放化疗毒性。

本实验研究氨磷汀对肿瘤细胞有无保护作用，是否会影响放射治疗效果。结果显示，A组、B组、C组与D组小鼠各时间点体质量差异无显著性，提示在放疗前30 min使用氨磷汀对肿瘤组织没有明显保护作用，对放射治疗效果没有明显影响。其可能原因：①氨磷汀发挥作用依赖于碱性磷酸酶的活性，正常组织碱性磷酸酶活性较高，所以氨磷汀及其代谢产物在正常组织中的浓度远远高于肿瘤组织(约100倍)[11]；②正常组织对氨磷汀的摄取是通过浓度依赖载体介导的扩散方式，而肿瘤组织依靠被动转运方式摄取氨磷汀，后者速度远低于前者[12]；③90%的氨磷汀在6 min内可从血浆内清除，其半衰期极短[13]。

本文结果还显示，第1天4组荷瘤鼠肿瘤体积比较差异无显著性，第3～13天A组肿瘤体积较其他3组减小，B组肿瘤体积较C、D组减小，差异有显著性，提示放疗对肿瘤的增殖有一定的抑制作用，氨磷汀对肿瘤组织无保护作用。本文A组肿瘤细胞凋亡率高于其他3组，B、C组高于D组，差异均有显著性；B组、C组比较，差异无显著性。提示氨磷汀可能对肿瘤细胞的凋亡具有促进作用。其机制可能为与p53基因诱导凋亡具有协同作用，也可能通过p53途径实现。

综上所述，肿瘤放射治疗前应用氨磷汀可减轻放射治疗相关副作用，其在保护正常组织细胞的同时对肿瘤细胞没有明显的保护作用；并且氨磷汀能够一定程度促进肿瘤细胞凋亡，提高放射治疗效果。

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(本文编辑 黄建乡)

THEPROTECTIVEEFFECTOFAMIFOSTINEONTUMORINCANCER-BEARINGMICEAFTERRADIOTHERAPY

MOUJunjun,ANYongheng

(Oncology Department, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore the protection effect of Amifostine (AMI) on tumor tissues in cancer-bearing mice after radiotherapy (RT) and its influence on efficacy of the therapy.MethodsA cultivation and passage of Lewis lung cancer lines were carried out, and single-cell suspension made, the cell density was then modulated to 106/L and subcutaneously injected to right lower limb to create a cancer-bearing model in mice. The mice were randomized to four groups as group A (AMI+RT), group B (RT), group C (AMI), and control group, with eight mice in each group. Before radiotherapy, an intraperitoneal injection of 5 mL (8 g/L) AMI was offered to the mice in group A and group C, a same dose of normal saline was given to those in group B and control group, 30 minutes later, the mice in groups A and B received local irradiation (6 MV-X, 10 Gy). The body weight and gross tumor volume were measured every two days. Fifteen days later, the mice were sacrificed for detecting apoptosis of tumor cells using TUNEL method.ResultsThe differences of body weight between the mice in the four were not significant (P>0.05). On the first day, tumor volume in the mice between the four groups were not significantly different (P>0.05), on days 3 to 13, the tumor volume in the mice of group A was decreased versus the other three groups, and that in group B was smaller than that in groups C and D, the differences being significant (F=4.290-15.470,P<0.05), and the difference between groups A and B, as well as C and D, no significant differences were noted (P>0.05). The cell apoptosis in group A was higher than that in the other three groups, and that in groups B and C was higher than that in group D, the differences were significant (F=36.535,P<0.01), and the difference of that between groups B and C was not significant (P>0.05).ConclusionAmifostine does not protect tumor tissues and affect the efficacy of radiotherapy. It’s likely that Amifostine has an action to promote apoptosis of tumor cells.

amifostine; radiotherapy; immunohistochemistry; apoptosis

2013-10-26;

2014-03-26

牟俊俊(1986-)，女，在读硕士研究生。

安永恒(1961-)，男，硕士，主任医师,硕士生导师。

R734.2

A

1008-0341(2014)03-0213-03