水果及蔬菜表面环孢子虫卵囊检测方法的建立

2014-09-27孙芳芳罗楠楠李俊强赵金凤李廷文黄建营张龙现

河南农业大学学报 2014年6期

关键词：洗洁精西葫芦生菜

孙芳芳，罗楠楠，李俊强，赵金凤，李廷文，黄建营，张龙现

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002；2.河南省人兽共患病国际联合实验室，河南郑州 450002)

水果及蔬菜表面环孢子虫卵囊检测方法的建立

孙芳芳1,2，罗楠楠1,2，李俊强1,2，赵金凤1，李廷文1,2，黄建营1,2，张龙现1,2

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002；2.河南省人兽共患病国际联合实验室，河南郑州 450002)

为了建立检测果蔬表面人源卡耶坦环孢子虫(Cyclosporacayetanensis)卵囊的方法,分别用 50，500 个环孢子虫卵囊对环孢子虫卵囊阴性的新鲜果蔬进行人工污染，并设置阴性对照；使用含有0.1% Alconox®，0.1% 雕牌，0.1% 立白、0.1% 白猫的4种洗涤液和去离子水，在摇床中洗脱样品；然后，反复离心 3 次收集卵囊并提取卵囊DNA；最后，基于环孢子虫18S rRNA基因位点对卵囊DNA样品进行巢式 PCR 扩增.结果表明,卵囊污染吸附最佳时间为24 h，样品洗脱最佳时间为30 min.其中，只用去离子水时，生菜、西葫芦、黄瓜、西瓜、甜瓜和草莓的检测敏感性可达到 50个卵囊，而西红柿可达到 500个卵囊；当用不同洗涤剂时，各样品的检测敏感性均可达到 50 个卵囊.不同洗涤剂之间检测敏感性无显著差异.该研究初步建立检测水果、蔬菜污染环孢子虫卵囊的技术，采用此方法可特异、敏感、快速的检测果蔬表面环孢子虫卵囊，为食源性环孢子虫病暴发溯源提供技术支持.

环孢子虫卵囊；18S rRNA；检测敏感性；巢式PCR

卡耶坦环孢子虫(Cyclosporacayetanensis)是一种新发现的人体肠道原虫，对免疫功能正常者可引起自限性腹泻，免疫抑制者或免疫功能缺陷者则可引起持续性腹泻甚至死亡[1～3].在发达国家，环孢子虫是引起大多数暴发性腹泻病的主要病原，多是通过发展中国家被污染的新鲜农产品传入，或由旅游者携带传播[4,5].在发展中国家，环孢子虫感染大多是本土性的，偶尔是伴发性[6].已报道与环孢子虫病暴发有关的食物有木莓、草莓、莴苣、罗勒和色拉等[7～9].另外，土壤中也存在环孢子虫，也有报道环孢子虫可经水源传播[10～12]，感染多发生在热带或亚热带地区，其感染情况随季节而改变，环孢子虫在夏季最为流行[13,14].2013年美国25个州暴发环孢子虫病，发现643个病例，可能与食用沙拉有相关性[15].中国的郑州和开封每年均发现有阳性病人，但其感染来源尚不清楚[16].由于环孢子虫病多发生于温暖湿润的雨季[14,17]，且多与水果、蔬菜有关[11,18]，推测患者感染环孢子虫与生食夏秋季节新鲜果蔬有一定关系.本试验选择7种夏季常见果蔬为研究对象，基于环孢子虫18S rRNA 基因的巢式PCR方法来检测果蔬表面的环孢子虫卵囊，为环孢子虫病的暴发溯源和流行传播提供技术支持.

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 环孢子虫卵囊卡耶坦环孢子虫卵囊由河南省人兽共患病国际联合实验室保存.2012年采集开封市淮河医院1名腹泻患者粪便样品，显微镜检查环孢子虫卵囊OPG值(克粪便卵囊值)达到 3.2×104，基于18S rRNA基因的序列分析确诊为环孢子虫，用蔗糖梯度离心法对获得的粪便样品进行纯化[19]，置于 2.5% 重铬酸钾溶液中4 ℃保存.

1.1.2 蔬菜及水果从超市购买新鲜的生菜、西葫芦、黄瓜、西瓜、甜瓜、草莓和西红柿.

1.1.3 洗涤剂本试验选择了4种洗涤剂，分别为Alconox®洗洁精、立白洗洁精、雕牌洗洁精和白猫洗洁精(使用时各洗涤剂均用去离子水稀释至0.1%)，Alconox®洗洁精由美国Alconox公司生产，有效成分是去电荷离子；立白洗洁精由立白集团生产，有效成分是十二烷基苯磺酸钠等；雕牌洗洁精由纳爱斯集团生产，有效成分是高效复合活性剂，APG (烷基糖苷)；白猫洗洁精由白猫集团生产，有效成分是表面活性剂.

1.1.4 主要仪器和设备 BagPage®+400 mL过滤袋，法国INTERSCIENCE公司；气浴恒温振荡器，江苏金坛市亿通电子有限公司；稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂；P×2 Thermal Cycler PCR仪，美国Applied Biosystems公司；凝胶成像分析系统，英国Syngene公司；微量加样器，德国Brand公司；SP-DT系列水平净化工作台，上海浦东伟普净化设备厂；低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；光学显微镜，日本Olympus公司等.

1.2方法

1.2.1 蔬菜及水果的清洗将从超市购买的生菜、草莓和西红柿样品用自来水冲洗5 min.室温下放置2 h晾干样品.将西葫芦、黄瓜、西瓜和甜瓜用水果刀削皮，将表皮用自来水冲洗5 min，室温下放置2 h晾干.

1.2.2 卵囊计数分别取5 μL纯化后的环孢子虫卵囊液和10 μL 50%甘油水滴加于洁净载玻片上[20]，混匀后加盖玻片，普通光学显微镜下观察计数，反复进行5次，其平均数即为环孢子虫卵囊原液的浓度(个·mL-1).

1.2.3 人工污染卵囊本试验参照STEELE等[21]和JOAN等[22]建立的方法及其研究结果，选择了50，500个环孢子虫卵囊进行试验.以去离子水作为稀释液，将环孢子虫卵囊液分别稀释至每100 μL含卵囊量为50个和500个.具体操作如下：称取相同质量晾干的生菜样品3份，(或者相同质量西葫芦、西瓜、黄瓜、甜瓜、草莓和西红柿各3份)，用加样器将稀释好的不同浓度环孢子虫卵囊液均匀人工污染到每份样品上[21]，第3份样品设置为阴性对照；在4 ℃下放置24 h，使卵囊完全吸附到样品表面.

1.2.4 洗脱卵囊用镊子将样品移至BagPage®+过滤袋中，加入100 mL洗涤剂，用袋夹密封袋口，放入摇床振荡洗脱[23, 24]，将滤液平均分装到2个50 mL的离心管中；再加入100 mL去离子水冲洗 BagPage®+过滤袋，将滤液分装到2个50 mL的离心管中；将滤液以3 000 r·min-1离心10 min；反复离心沉淀3次，收集沉淀到2 mL的离心管中，置于4 ℃冰箱中保存.

1.2.5 比较不同质量样品洗脱效果参照PALMER等[24]试验中样品的用量，称取25 g或15 g生菜样品各3份(或者25 g或15 g西葫芦、黄瓜、西瓜和甜瓜样品各3份，50 g草莓样品3份，100 g西红柿样品3份)，用加样器将稀释好的不同浓度环孢子虫卵囊液均匀人工污染到样品上[23]，分别人工污染50个和500个卵囊，并设置1个阴性对照.卵囊人工污染果蔬吸附时间为24 h，摇床振荡洗脱30 min，收集卵囊后进行PCR扩增.

1.2.6 比较不同洗脱时间样品洗脱效果选取洗脱效果好的样品质量，样品吸附卵囊时间为24 h，袋夹密封袋口，参照文献[21,24]的样品洗脱时间，将样品放入摇床振荡30 min(或者20 min)进行洗脱，收集卵囊后进行PCR扩增.

1.2.7 比较不同洗涤剂对各样品的洗脱效果参照JOAN等[23]的方法，选择国内市场上常用的3种洗洁精和Alconox®洗洁精，分别取100 μL的洗洁精，加入到100 mL的去离子水中，配成浓度为0.1% 的洗涤剂.取洗脱效果好的样品质量及洗脱时间，样品吸附卵囊时间为24 h，把样品移至 BagPage®+过滤袋中，加入100 mL去离子水(或者100 mL 0.1%的Alconox®洗洁精、0.1%的立白洗洁精、0.1%的雕牌洗洁精、0.1%的白猫洗洁精)，收集卵囊后进行PCR扩增.

1.2.8 比较卵囊吸附不同时间时各样品洗脱效果取洗脱效果好的样品质量及洗脱时间，使用0.1%的Alconox®洗洁精，参照JOAN等[21]和STEELE等[23]试验中样品吸附卵囊的时间，将人工污染卵囊后的样品在4 ℃下放置24 h(或者12 h)，收集卵囊后进行PCR扩增.

1.2.9 样品DNA提取样品 DNA 提取采用美国OMEGA Bio-Tek公司生产的 Stool DNA Kit试剂盒(D4015-02)，根据说明书步骤进行，提取后的 DNA 置于-20 ℃ 冰箱保存备用.

1.2.10 PCR扩增参照肖淑敏等[25]设计的引物，扩增长度为501 bp的环孢子虫18S rRNA基因片段，引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成.引物序列见表1.

反应体系：第 1 次 PCR 反应：在25 μL的反应体系中加入模板 DNA 1 μL，50 μmol·L-1引物各0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，KOD-plus 酶0.5 μL，Mg2+1.5 μL，加灭菌双蒸水到25 μL.第2次PCR反应：在25 μL的反应体系中加入第1次反应产物 1 μL作为模板，50 μmol·L-1引物各 0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，kOD-plus 酶0.5 μL，Mg2+1.5 μL，加灭菌双蒸水到 25 μL.

表1 环孢子虫18S rRNA基因巢式PCR引物Table 1 Nested PCR primers of Cyclospora 18S rRNA gene

反应步骤：第 1 次反应和第2次反应均为：预变性 94 ℃，7 min；然后 35 个循环：(94 ℃，30 s；55 ℃，30 s：72 ℃，90 s)；最后延伸72 ℃，7 min.

1.2.11 PCR扩增灵敏性和特异性试验取100 μL含环孢子虫卵囊量为分别为10，20，40，60，80，100，200，300，400，500个的卵囊液，进行 DNA 提取，以双蒸水为阴性对照，基于本试验中选用的18S rRNA基因引物进行扩增，然后进行凝胶电泳，对出现目的条带的样品进行测序，并对所测序列结果进行 Blast 搜索和序列比对.

微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)，肠贾第虫(Giardiaintestinalis)，羊无浆体(Anaplasmaovis)，环形泰勒虫(Theileriaannulata)，猪带绦虫(Taeniasolium)，猪流感病毒(Swineinfluenzavirous)的阳性 DNA 均由本实验室提供，沙门氏菌(Salmonella)，大肠杆菌(Escherichiacoli)，新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)的阳性 DNA 由河南农业大学微生物学实验室提供，基于本试验中选用的 18S rRNA 基因引物进行扩增，然后进行凝胶电泳.

2 结果与分析

2.1PCR扩增灵敏性和特异性

10个样本均出现 500 bp左右的扩增条带，PCR产物均与设计的目的片段大小相符，未出现非特异性条带.对所测序列结果进行Blast搜索和序列比对，与卡耶坦环孢子虫同源性为100%.PCR扩增结果如图1所示.

基于本试验中选用的 18S rRNA 基因引物进行扩增，对Cryptosporidiumparvum，Giardiaintestinalis，Anaplasmaovis，Theileriaannulata，Taeniasolium，Swine influenza，Salmonella，Escherichiacoli，Newcastle Disease Virus的阳性 DNA 进行PCR扩增的结果如图2所示.

M.DL2000分子标记；P.阳性对照；1～10.卵囊量为10，20，40，60，80，100，200，300，400，500个的PCR扩增结果；N.阴性对照.

M.DL2000分子标记；C.卡耶坦环孢子虫；1.微小隐孢子虫；2.肠贾第虫:3.绵羊无浆体:4.环形泰勒虫；5.大肠杆菌；6.沙门氏菌；7.猪带绦虫；8.猪流感病毒；9.新城疫病毒； N.阴性对照.

2.2不同质量果蔬检测情况

人工污染 500 个卵囊，不同质量的样品均出现目的条带，且结果稳定；人工污染 50 个卵囊，生菜、西葫芦、西瓜、黄瓜和甜瓜样品25 g，3次 PCR 扩增结果不稳定，草莓 50 g，出现目的条带；西红柿100 g，未出现目的条带.生菜、西葫芦、西瓜、黄瓜和甜瓜为15 g，3次 PCR 扩增均能出现目的条带(图 3 , 图4 ).

2.3不同洗脱时间检测情况人工污染卵囊数量为500个洗脱时间为30 min和20 min 时，各样品3次PCR扩增均能出现目的条带.人工污染卵囊数量为50个，洗脱时间为20 min时，生菜、西葫芦、西瓜、黄瓜、甜瓜和草莓3次PCR扩增结果不稳定，西红柿未出现目的条带；人工污染卵囊数量为50个，洗脱时间为30 min时，生菜、西葫芦、西瓜、黄瓜、甜瓜和草莓3次PCR扩增均能出现目的条带，西红柿未出现目的条带(图5和图6).

M.DL2000分子标记；P.阳性对照；1.生菜，0个；2.生菜，50个；3.生菜，500个；4.西葫芦，0个；5.西葫芦，50个；6.西葫芦，500个；7.黄瓜，0个；8.黄瓜，50个；9.黄瓜，500个；10.西瓜，0个；11.西瓜，50个；12.西瓜，500个；13.甜瓜，0个；14.甜瓜，50个；15.甜瓜，500个；16.草莓，0个；17.草莓，50个；18.草莓，500个；19.西红柿.0个；20.西红柿.50个；21.西红柿.500个；N.阴性对照.

M.DL2000分子标记；P.阳性对照；1.生菜，0个；2.生菜，50个；3.生菜，500个；4.西葫芦，0个；4.西葫芦，50个；6.西葫芦，500个；7.黄瓜，0个；8.黄瓜，50个；9.黄瓜，500个；10.西瓜，0个；11.西瓜，50个；12.西瓜，500个；13.甜瓜，0个；14.甜瓜，50个；15.甜瓜，500个；16.草莓，0个；17.草莓，50个；18.草莓，500个；19.西红柿.0个；20.西红柿.50个；21.西红柿.500个；N.阴性对照.

2.4不同洗涤剂的洗脱效果比较

使用不同洗涤剂成分，检测各种水果、蔬菜表面环孢子虫卵囊的洗脱效果.当使用 0.1% 的Alconox®洗洁精、0.1% 的立白洗洁精、0.1% 的雕牌洗洁精、0.1% 的白猫洗洁精时，进行3次平行试验，生菜、西葫芦、黄瓜、西瓜、甜瓜、草莓和西红柿的检测敏感性均可达到50 个(图7～图10)

2.5卵囊吸附时间长短对检测效果的影响

卵囊分别吸附 12 h和24 h，均用0.1% Alconox®洗洁精，进行 3 次平行试验，各样品检测敏感性均能达到 50 个卵囊(图 11，图12 ).

3 小结与讨论

在世界范围内，由于食用水果、蔬菜而感染环孢子虫的病例不断有报道.在1995—2001 年，在美国的各大州相继有关于环孢子虫病暴发的报道，与罗勒、生菜、苹果沙拉和鸡肉沙拉有关[26]，2013年6月至8月美国25个州暴发环孢子虫病，发现643个病例，已查明与产自“泰勒农场”墨西哥分公司的受污染袋装沙拉有关,包括卷心生菜、叶生菜、紫甘蓝及胡萝卜[15]，MILORD等[5]对加拿大250名有胃肠炎症状的工人进行了调查，发现了环孢子虫卵囊的存在，这些人都食用过从墨西哥进口的罗勒.为了了解水果、蔬菜表面环孢子虫卵囊的污染情况，国外学者已经建立了水果、蔬菜表面环孢子虫卵囊的检测方法，STEELE等[21]使用无菌去离子水对树莓、罗勒和莴苣进行洗涤，对树莓和罗勒的检测灵敏度可以达到40个·100 g-1，甚至更少，对莴苣的检测灵敏度只能达到 1 000个·100 g-1.SHIELDS 等[22, 23]对 dH2O，PBS和Alconox®洗洁精等不同的洗涤剂洗涤效果进行了比较，结果发现Alconox®洗洁精的效果最好，对罗勒表面环孢子虫卵囊的回收率最高可达到 90.1% 以上，对生菜叶子上环孢子虫卵囊的回收率最高可以达到80.6%.PALMER等[24]建立的方法，在洗涤剂中添加了NET-BSA缓冲液和PVPP，pH值为5.5.本研究结果表明，当生菜、西葫芦、西瓜、黄瓜和甜瓜样品的质量为25 g时，检测敏感性不能达到50个，当减少这几种样品的质量为15 g时，检测敏感性能达到50个.分析这种结果的原因可能是过滤袋的空间有限，样品表面积不宜过大，过大会导致洗脱不充分.只用去离子水时，西红柿的检测敏感性不能达到50个.分析原因可能是西红柿表面的缝隙小，卵囊被吸附后不易洗脱，而使用洗涤剂时洗脱效果较好.在对洗脱时间对洗脱效果影响的比较中，选择了20 min和30 min进行对比.研究结果发现，洗脱时间为20 min时，进行平行试验的结果很不稳定，洗脱时间为30 min时，平行试验结果稳定可靠.这就为流行病学调查时样品取量以及样品洗脱时间提供了稳定可靠的依据.STEELE 等[21]等证明，采用不同成分的洗涤剂对吸附在蔬菜、水果表面的环孢子虫卵囊进行洗脱，0.1% 的Alconox®洗洁精效果最好，因此本实验选择了Alconox®洗洁精以及国内市场上常用的立白、雕牌和白猫洗洁精进行对比，结果无显著性差异.考虑到经济效益问题，在进行流行病学调查时，可选用立白、雕牌和白猫洗洁精的任意一种进行试验.试验证明样品吸附卵囊12 h和24 h洗脱结果没有显著性差异，说明当卵囊吸附时间为12 h时，样品已经可以完全将卵囊吸附，洗脱结果是可靠的.

本试验建立了一种快速、简便、稳定可靠的检测果蔬表面环孢子虫卵囊的方法，其检测敏感性均可达到50个，建立此方法可以探讨病原传播的介质是哪些食品原料，为进一步追溯暴发来源提供技术支撑.

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(责任编辑：蒋国良)

DevelopmentofmethodfordetectingCyclosporaoocystsonthesurfaceoffreshfruitsandvegetables

SUN Fang-fang1,2, LUO Nan-nan1,2, LI Jun-qiang1,2, ZHAO Jin-feng1, LI Ting-wen1,2, HUANG Jian-ying1,2, ZHANG Long-xian1,2
(1.College of Animal Husbandry and Veterinary Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002，China; 2.International Joint Research Laboratory for Zoonotic Disease Henan Province, Zhengzhou 450002, China)

In order to develop a method for detection of humanCyclosporacayetanensison the surface of vegetables and fruits, 50 and 500Cyclosporaoocysts were artificially contaminated to the surface of fruits and vegetables, and a negative control was used. The samples were washed using different kinds of detergent (0.1% Alconox®, 0.1% Liby, 0.1% Diaopai, and 0.1% Baimao) by the gas bath thermostats oscillator, then oocysts were collected after three times centrifuge and DNA was extracted. Finally, the DNA samples were detected by nested PCR amplification of the 18S rRNA gene. The results show that the optimal time for oocysts absorption to substance is 24 hours, and the optimal washing time for samples is 30 minutes. When using 100 mL deionized water, the minimum detectable level of lettuce, zucchini, cucumbers, watermelons, melons and strawberries was 50 oocysts, respectively, but for tomatoes it was 500 oocysts. When using the 4 different kinds of detergent, the minimum detectable level of each sample could be 50 oocysts. There are no significant differences between different kinds of detergent. The method for the detection of Cyclospora oocysts adsorped to fruit or vegetables was developed primarily. It is quick, sensitive, and specific for the detection of the food-borne pathogen.

Cyclosporaoocysts; 18S rRNA; detectable sensitivity；nested PCR

1000-2340(2014)06-0713-08

Q958.9

：A

2014-05-10

国家科技重大专项(2012ZX10004220)；河南省高校科研创新团队项目(012IRTSTHN005)

孙芳芳，1987年生，女，河南禹州人，硕士研究生，从事人兽共患寄生虫病研究．

张龙现，1965年生，男，河南汝州人，教授，博士生导师.