小鼠肾脏中CD133表达的研究

刘 伟，马云胜，穆长征，田 鹤

（辽宁医学院组织学与胚胎学教研室，辽宁锦州121000）

肾脏损伤后可以再生，原因是由于在肾脏组织中存在一部分再生能力较强，具有一定自我更新能力的干细胞样细胞成分。从目前的研究结果看，由于肾脏中细胞成分复杂，肾脏中有可能存在几种干／祖细胞，因此其标志物亦可能根据不同的节段而不同。Bussolati等［1］发现从人肾脏中分离培养的CD133细胞具有较强的增殖能力，也可以分化为上皮或内皮细胞，修复小管损伤，因此这群细胞具有干细胞特性。本研究在小鼠肾脏原位检测CD133细胞的表达与分布，从空间定位角度分析该细胞的位置及数量，为该细胞组织修复提供数据支持，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 选取昆明小鼠12只（辽宁医学院实验动物中心提供，清洁级，雌雄不限，35～30g，3月龄）；兔抗CD133（北京博奥森公司），DAB（武汉博士德公司）；HRP标记的羊抗兔IgG（北京中杉金桥公司）。

1.2 方法

1.2.1 肾脏组织的采集 取成熟健康昆明小鼠，左心室灌流固定后，取双侧肾脏，4%多聚甲醛固定24h后，梯度乙醇脱水，入二甲苯透明，60℃浸蜡3h，包埋制成石蜡块。

1.2.2 切片制备与CD133免疫组织化学检测 用Leca3215切片机将肾脏组织切成5μm厚度切片，黏附于涂有多聚赖氨酸的防脱片上，60℃烤片2h后，切片二甲苯脱蜡2h，梯度乙醇下行入水。3%过氧化氢清除内源性过氧化物酶5min，枸橼酸盐缓冲液高压锅法进行抗原修复。自然冷却后，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，每次5min，组画笔画圈，5%BSA封闭10min室温下滴加兔抗CD133（1∶200）抗体。湿盒内4℃冰箱过夜。次日取出去除一抗，PBS洗3次，滴加HRP标记的羊抗兔IgG，室温孵育1h，PBS洗3次，DAB显色并观察，适时终止显示，清水冲洗，苏木精复染细胞核，梯度乙醇脱水，树胶封片。

1.2.3 免疫蛋白印迹法（Western blot）检测CD133表达 取整个肾脏，眼科剪剪碎，加1mL蛋白裂解液，超声波使细胞充分裂解，然后分别转移到1.5mL的离心管中，置于冰中30 min，然后4℃下12 000r／min离心40min，取总蛋白每孔30 μg，100 ℃ 煮 沸 10min，10% 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 （SPSPAGE）分离总蛋白，然后将蛋白转移至聚偏氟乙烯（PDVF）膜上，用5%脱脂奶粉封闭2h，一抗（兔抗CD133，1∶500）4℃孵育过夜，次日加二抗（1∶1 500）孵育2h，ECL显色。

1.3 统计学处理 Western blot结果采用系统自带软件对目的条带进行光密度值的分析。采用SPSS13.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析比较样本均数，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组织化学结果 CD133阳性细胞分布于肾脏的皮质和髓质（图1）。在皮质区域，CD133表达于一小部分远端小管上皮细胞的顶端（图1a），散在分布，注意CD133都表达在靠近肾小体血管极的远端小管曲部上。偶尔在细胞质里也可见到阳性表达（图1b）。甚至有少量CD133细胞表达在小管上皮细胞的侧面和整个小管的周围。在髓质和肾乳头区域CD133表达于升支粗段，细段和集合管（图1c）。在内髓CD133分布的较外髓内带要广泛，并且以一小群细胞或单个细胞表达形式存在（图1d～f）。

图1 小鼠肾脏中CD133的免疫组织化学结果

2.2 Western blot检测结果 Western blot检测提示小鼠肾脏组织中均检测到CD133表达，在120×103左右出现特异性结合条带，见图2。

图2 小鼠肾脏组织CD133Western blot结果

3 讨 论

肾脏中组织成分复杂，其损失后修复的机制可能有多种。肾小管上皮细胞具有一定的更新能力，这说明肾小管上皮必然存在具有干细胞属性的细胞成分。而在很多疾病导致的肾脏小管上皮细胞坏死等都依赖于肾小管上皮细胞的修复和再生，以重新恢复其营养重新收及水代谢功能。CD133被认为是肿瘤细胞标志物，在某些肿瘤如肾透明细胞癌中呈大量阳性表达。CD133也可以被认为是一群干／祖细胞标志物，CD133抗原早期用于从造血组织和神经组织中分离干细胞，在造血组织中CD133只表达于CD34阳性干细胞和祖细胞上［2］。此外，在骨骼肌和神经组织中也存在一部分CD133阳性细胞［3］。Osafune等［4］从肾脏细胞中分离的CD133细胞不表达CD34和CD45，这说明在不同的组织中表达CD133细胞是不同的。Bruno等［5］在体外研究发现该细胞具有自我更新和复制的能力。此外从形态上看CD133细胞具有明显的极性，这说明他们具有分化细胞的特征。体外研究表明，CD133细胞具有较强的扩增能力，标记后的CD133细胞静脉注射到SCID小鼠后，该细胞在肾小管并修复了肾小管损伤，从而修复肾脏损伤［6－7］。

本研究发现，在成年小鼠的肾脏内髓，肾乳头区集合管，细段，广泛分布着CD133阳性细胞。而在皮质和外髓区CD133阳性细胞的数量较少，仅限于髓放线集合管和肾单位区髓袢升支细段和远曲小管，皮质集合管则没有分布。Lazzeri等［8］应用Brud标记法发现肾乳头区细胞增殖能力强，表现为大量的标记细胞出现，并认为该区为肾脏干细胞的定居点［8］，本研究发现，CD133分布在内髓肾乳头区较多，少量分布于外髓的集合管和肾单位远端小管。作者的发现进一步印证了O′Neill等［9］的观点，该观察可以为对于肾脏损伤修复的细胞分布的空间位置关系提供形态学依据，同时本研究也可能解释远端小管修复机制，下一步实验应该研究在肾脏损伤疾病模型上CD133的表达情况，进一步揭示肾脏损伤及修复的机制。总之，肾脏中干细胞表达CD133，本实验从原位寻找CD133表达位置，为肾脏干细胞提供空间表达数据。

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