亚硝酸盐氮对克氏原螯虾成虾的毒性及其抗病因子的影响

2014-09-26钟君伟朱永安付佩胜安丽吕宝玉山东省淡水渔业研究院山东省淡水水产遗传育种重点实验室山东济南250013

长江大学学报(自科版) 2014年5期

钟君伟，朱永安，付佩胜,安丽，吕宝玉（山东省淡水渔业研究院，山东省淡水水产遗传育种重点实验室，山东济南 250013）

在水产动物养殖中，尤其是高密度养殖模式下，人工向水体投入大量的配合饲料，水体中有机代谢废物大量沉积，特别是亚硝酸盐浓度逐渐升高，往往引起水产动物的的生理异常甚至死亡，其产生的毒性作用直接影响动物的存活、生长和发育，成为诱发病害的主要因子。国内外许多学者研究了亚硝酸盐对水产动物的急性毒性效应，进行了病理学研究并探讨了其中毒机理[1－5]。

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）俗称淡水小龙虾，分类学上属节肢动物门甲壳纲软甲亚纲十足目螯虾亚目蜊蛄科原螯虾属，原产北美洲，20世纪30年代末由日本传入我国。由于其因肉味鲜美，适应性广、繁殖力强，能适应稻田、池塘、滩地等多种水域养殖，已成为我国重要的水产经济虾类，是目前我国水产业中发展最为迅速、最具特色、最有潜力的养殖品种之一。目前对克氏原螯虾的研究主要集中在繁殖生物学、营养生理、基础代谢、重金属污染等方面[6－11]，而有关环境因子亚硝酸盐氮对克氏原螯虾影响，仅见于对幼虾、仔虾的急性毒性效应研究[12－13]，未见对其成虾的毒性效应报道及其亚硝酸盐胁迫对相关免疫指标的影响。本研究不仅探讨了亚硝酸盐对克氏原螯虾成虾的急性毒性效应，而且进一步测定其在安全浓度状态下克氏原螯虾肝胰腺超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）活性在72h内的变化情况，以进一步探明克氏原螯虾受到亚硝酸盐作用后相关免疫因子的变化情况，为克氏原螯虾的健康养殖提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用克氏原螫虾体重为（9.32±1.57）g，体长为（6.91±0.41）cm，取自山东省东平县第一淡水养殖试验场，在室内暂养7d。暂养和试验容器均为装有20L水的塑料水族箱（57cm×40cm×34cm），试验前24h停食，并从中选择体质健壮、体色一致、活动性强和附肢完整的成虾作为试验用虾。

试验在山东省淡水渔业研究院国家级水产良种场温室中进行，试验水源为玉景矿泉水厂700m深井水，其水质指标如下：水温（20.9±2.9）℃，pH 7.86，DO （5.24±0.63）mg／L，溶解性总固体（TDS）（0.44±0.05）mg／L；0.03mg／L；未检出。试验期间采用24h连续充气增氧，试验期间不控温不投喂。

1.2 试验方法

（1）亚硝酸盐对克氏原螯虾的急性毒性试验经预备试验，确定各组药物质量浓度范围（96h全活质量浓度上限和24h全部致死质量浓度下限）后，在室温条件下，采用半静水停食实验法，按等对数间距设置7个质量浓度梯度组（16.00、24.11、36.32、54.72、82.44、124.20mg／L和187.12mg／L）和1个清水对照组，每组3个平行，为保证试验期间药物浓度的稳定，每24h全部换液1次。

试验开始的前10h连续观察，及时取出死亡成虾并排污，记录24、48、72、96h各组虾的症状及死亡数。其死亡的个体以镊子碰触虾体腹部完全无反应为标准。

根据试验结果，参照谭苹[14]的方法，按改良寇氏法求出各药物的半数致死质量浓度（LC50），再求得安全浓度（SC）。

安全浓度（SC）＝48hLC50×0.3／（24hLC50／48hLC50）2

式中，24hLC50、48hLC50分别为24、48h的半致死质量浓度。

（2）亚硝酸盐对克氏原螯虾抗病因子影响试验胁迫浓度在安全浓度（12.32mg／L）基础上设置为12mg／L亚硝酸盐氮浓度组和0mg／L对照组。准确称取亚硝酸钠放入装有20L水的塑料水族箱（57cm×40cm×34cm）溶解完全后，每试验组随机放入活性旺盛的克氏原螯虾20只，每平行重复2组。持续充气，每24h更换试验溶液1次以维持药物浓度。

于胁迫后12、24、48、60h和72h分别从试验组和对照组随机取出3只虾，在冰上迅速采集肝胰腺组织样品，分别加9倍质量0.85%预冷无菌生理盐水制备成10%的组织匀浆，在冰浴条件下进行匀浆。匀浆液经3000r／min4℃离心15min，吸取上清液于洁净的离心管中－20℃保存备用。

采用南京建成生物技术有限公司生产的试剂盒分别测定肝胰腺的氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）活性，测定方法按照试剂盒使用说明书进行。每个样品重复2次。T-SOD定义为每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活性单位（U／mgProt）；组织中CAT以1mg蛋白1s分解1μmol的H2O2的量为1个活性单位（U／mgProt）；ACP定义为每克组织蛋白在37℃与基质作用15min产生1mg酚为1个活性单位（U／gProt）；AKP定义为每克组织蛋白在37℃与基质作用15min产生1mg酚为1个活性单位（U／gProt）；采用考马斯亮蓝显色法测定总蛋白含量，单位为g／L。

胁迫影响的相关试验数据采用SPSS19.0软件处理，并采用双尾t检验法对数据进行差异显著性分析，以P≤0.05作为差异显著标准。

2 结果与分析

2.1 亚硝酸盐对克氏原螯虾的毒性

试验初期，试验组克氏原螯虾活动状况与对照组基本相似，都散落在箱体底部缓慢爬动，碰触后反应敏捷。随着接触时间的延长，克氏原螯虾在不同试验组中出现不同程度的游动加剧、上下串游、游动迟缓等不安状况。试验开始5h后，124.20mg／L和187.12mg／L浓度组出现中毒症状，部分成虾急躁不安，沿箱壁快速游动。7h后行动减缓，不时侧游、侧翻，游泳足摆动缓慢，若受触动，能迅速逃游，但片刻后又侧翻、侧游，有部分虾腹部朝上弯曲，反应迟钝。10h后187.12mg／L组平均已有4尾身体弯曲，体色变暗，活动微弱，若受惊，已不能逃游，呈昏迷状态，沉入水底不动。24h后死亡成虾体色变暗，头胸部与腹部有明显的分节。

表1为亚硝酸盐氮对克氏原螯虾成虾的急性毒性试验结果。在一定试验时间内，随着的浓度越高，克氏原螯虾的死亡率越高；而在相同的染毒时间内，浓度越高，克氏原螯虾的死亡率越高。依据表1的数据，根据改良寇氏法计算对克氏原螯虾的24、48、72h和96hLC50（95%可信区间）分别为 118.00mg／L （94.21～147.78mg／L）、83.00mg／L （65.87～104.59mg／L）、41.07mg／L （32.97～51.16mg／L）和 35.70mg／L （29.03～43.92mg／L），安全质量浓度（SC）为12.32mg／L。

表1 亚硝酸盐氮对克氏原螯虾成虾的急性毒性试验结果

2.2 亚硝酸盐氮对克氏原螯虾肝胰腺T-SOD和CAT活性的影响

水体中亚硝酸盐氮在安全浓度内对克氏原螯虾成虾肝胰腺抗氧化酶类活性影响如图1所示。对照组肝胰腺T-SOD活性在60h内相对稳定，呈小幅波动，差异不显著（P＞0.05），随着饥饿时间的延长，在72h时显著降低至（15.24±2.99）U／mgProt；在12mg／L胁迫24h后，肝胰腺T-SOD活性迅速降低（P＜0.05），此后T-SOD活性均明显低于对照组（P＜0.05），除48h外，抑制程度逐渐增加，在72h时抑制程度最高为37.77%。说明12mg／L对肝胰腺T-SOD活性影响主要表现为抑制作用，且随着时间延长抑制程度加深。

对照组肝胰腺CAT活性在72h内相对稳定，呈小幅波动，差异不显著（P＞0.05）；在12mg／L胁迫12h后，肝胰腺T-SOD活性迅速降低（P＜0.05），在24h时抑制程度最高为55.18%。虽在60h后CAT活性有所上升，但明显低于对照组（P＜0.05）。说明在12mg／L对肝胰腺CAT活性影响主要表现为抑制作用，且抑制时间要早于T-SOD。

图1 亚硝酸盐氮胁迫对克氏原螯虾抗氧化酶类活性的影响

2.3 亚硝酸盐氮对克氏原螯虾肝胰腺酸、碱磷酸酶活性的影响

水体中亚硝酸盐氮在安全浓度内对克氏原螯虾成虾肝胰腺酸、碱磷酸酶活性的影响如图2所示。图2显示：整个试验过程中，在12mg／L胁迫下，克氏原螯虾肝胰腺ACP和AKP活性表现出相似的变化规律，即在12h时均显著高于对照组（P＜0.05），其中 ACP达到（255.65±36.22）U／gProt，AKP升高至（14.50±1.96）U／gProt；随着时间延长，试验组ACP和AKP活性迅速降低至对照组水平，且差异不显著（P＞0.05）。说明克氏原螯虾肝胰腺ACP和AKP能在较短时间内对12mg／L胁迫产生响应，并能快速适应胁迫环境。

图2 亚硝酸盐氮胁迫对克氏原螯虾酸、碱磷酸酶活性的影响

3 讨论

亚硝酸盐是养殖水体中重要的污染物，是导致甲壳动物免疫能力降低、疾病发生的重要因素，可引起机体生理生化因子及组织结构的改变，并能改变与免疫抗病能力有关酶类的活性。在试验过程中，中毒克氏原螯虾先表现为游动加剧，后动作迟缓；死亡个体体色变暗，头胸部与腹部有明显的分节。其安全质量浓度（SC）为12.32mg／L，是幼虾[12]（SC 为6.97mg／L）及仔虾[13]（SC 为1.52mg／L）的1.77倍和8.11倍，这说明克氏原螯虾对的耐受力随个体发育而逐渐增强。

亚硝酸盐中毒组织病变最严重的器官是肝胰腺[15]，且会对甲壳动物的免疫系统产生抑制作用，使其免疫功能下降。王玥等[16]以1mg／L的亚硝态氮作用于罗氏沼虾10d后，使其血清、肝胰腺和肌肉组织中的PO、SOD、ACP及AKP的活性显著降低，降低了该虾的免疫功能。本试验结果表明，12mg／L对肝胰腺T-SOD及CAT活性影响主要表现为抑制作用，且CAT活性且抑制时间要早于T-SOD，T-SOD活性随着时间延长抑制程度加深。说明即使处于安全浓度内，12mg／L仍会抑制肝胰腺T-SOD及CAT活性，导致清除体内氧自由基能力降低，对克氏原螯虾产生一定毒性。

在甲壳动物的免疫体系中，ACP和AKP均为磷酸单酯酶，主要分布在肝胰腺、血淋巴中，是甲壳动物溶酶体酶的重要组成成分，在免疫应答中起重要的作用。肝胰腺作为重要的解毒器官和脂肪代谢场所，其中具有水解酶作用的ACP含量较为丰富，因而ACP活力必然高得多，这点在本研究中也得到进一步验证。本研究中肝胰腺ACP和AKP除在12h时活性显著增强外，其他时间下与对照组差异并不明显，因此克氏原螯虾肝胰腺ACP和AKP能在短时间内对12mg／L应激产生响应，并能尽快适应。这点与对红螯光壳螯虾幼虾肝胰腺ACP和AKP的抑制影响不同[5]，这可能与受试物种、虾体规格或试验条件有关。

《渔业水质标准》规定，养殖水体中亚硝酸盐不高于0.2mg／L，而对克氏原螯虾成虾的安全浓度分别为12.32mg／L，是水质标准的，61.6倍，说明克氏原螯虾成虾能搞耐受较高浓度的；但即使处于安全浓度内，虽然不会导致成虾死亡，12mg／L依然能够抑制抑制肝胰腺T-SOD及CAT活性。

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