HPLC-ELSD同时测定柿叶中齐墩果酸及熊果酸含量

盛晓静，杨群，祝兴勇，张晓云

(九江市食品药品检验所，江西 九江 332000)

HPLC-ELSD同时测定柿叶中齐墩果酸及熊果酸含量

盛晓静*，杨群，祝兴勇，张晓云

(九江市食品药品检验所，江西 九江332000)

目的：建立测定柿叶中齐墩果酸和熊果酸含量的高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)。方法：以甲醇为提取溶剂，色谱柱为WatersSunFireTMC18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-甲醇-1.0%醋酸铵溶液(55∶25∶20)，流速为1.0mL·min-1，柱温为25℃。蒸发光散射检测器漂移管温度为90℃，气体压力为0.17MPa。结果：齐墩果酸的量在0.1325～1.656μg呈良好线性关系(r=0.9998)，回收率为98.86%；熊果酸的量在0.3704～4.630μg呈良好线性关系(r=0.9986)，回收率为98.88%。结论：所建立的方法简单准确、重现性好，可用于柿叶的质量控制。

柿叶；齐墩果酸；熊果酸；高效液相色谱-蒸发光散射检测法；含量测定

柿叶为柿科植物柿DiospyroskakiThunb.的干燥叶，具有清肺止咳，凉血止血，活血化瘀，降血压的功能。用于咳喘，肺气胀，各种内出血，高血压，脑动脉硬化症，冠心病[1]。据文献报道，柿叶含有萘酮类、黄酮类、萜类、鞣质、谷山醇类、酚类、香豆素类、有机酸、胡萝卜素和维生素C等化学成分[2-3]。齐墩果酸和熊果酸为柿叶中的五环三萜类化合物，齐墩果酸具有消炎、增强免疫力、抑制血小板降集、降糖等多方面的药理作用，熊果酸具有强心、降血脂、降血糖、抗癌等药理作用，尤其在抗肿瘤、抗氧化、抗炎保肝、降血脂方面的作用显著[2-6]。由于齐墩果酸与熊果酸在紫外区均为末端吸收，采用高效液相色谱-紫外检测器法(HPLC-UV)测定时干扰较大，笔者采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)同时测定柿叶中齐墩果酸与熊果酸的含量，方法简单准确、重现性好，可用于柿叶的质量控制。

1 仪器与试药

1.1仪器

Waters高效液相色谱仪(e2695型分离模块，2424型蒸发光散射检测器，Empower工作站)；SartoriusBp211D分析天平；YIY-UL300W-C型超声波清洗器。

1.2试药

齐墩果酸、熊果酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为110709-200304，110742-200517)；重蒸水，色谱乙腈，色谱甲醇，其他试剂均为分析纯。

10批柿叶药材的来源及产地信息见表1，均经九江市食品药品检验所中药室鉴定为柿科植物柿DiospyroskakiThunb.的干燥叶。

表1 10批柿叶药材的来源及产地信息

2 方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：WatersSunFireTMC18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈-甲醇-1.0%醋酸铵溶液(55∶25∶20)，流速：1.0mL·min-1；蒸发光散射检测器：雾化器温度为30℃，漂移管温度为90℃，载气为氮气，气体压力0.17MPa。理论塔板数按齐墩果酸峰计算不低于10000，齐墩果酸与熊果酸均能有效分离且峰形较好。

2.2混合对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品8.28mg、熊果酸对照品15.43mg，分别置于25mL量瓶中，加甲醇适量使其溶解，并稀释至刻度，摇匀，分别作为齐墩果酸及熊果酸对照品母液；再精密吸取齐墩果酸对照品母液2mL、熊果酸对照品母液3mL置同一10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3供试品溶液的制备

取柿叶样品粉末(过二号筛)约1g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率240W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4测定方法

分别精密吸取混合对照品溶液5，20μL，供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

2.5线性关系的考察

取混合对照品溶液2，5，10，20，25μL分别注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以进样量的常用对数为横坐标，以峰面积的常用对数为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归分析，得齐墩果酸回归方程为Y=5774.4X+1252.1，r=0.9998，结果表明齐墩果酸的量在0.1325～1.656μg呈良好线性关系；得熊果酸回归方程为Y=5753.3X+1320.3，r=0.9986，结果表明熊果酸的量在0.3704～4.630μg呈良好线性关系。

2.6精密度试验

精密吸取对照品混合溶液10μL进样，重复进样5次，按上述色谱条件测定，齐墩果酸峰面积对应常用对数值的RSD=0.10%，熊果酸峰面积对应常用对数值的RSD=0.07%，结果表明本方法的精密度良好。

2.7稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液10μL(10号样品)，分别于0，2，4，6，8，10h按上述方法进样分析，测定齐墩果酸及熊果酸峰面积常用对数值的RSD分别为0.13%，0.06%，结果表明供试品溶液在10h内稳定。

2.8重复性试验

取同一批柿叶样品(10号样品)，按上述方法操作，平行试验6次，测得齐墩果酸平均质量分数为0.263%，RSD=1.03%；熊果酸平均质量分数为0.700%，RSD=1.29%。结果表明，在同一条件下，6次测得样品含量一致，本方法重复性良好。

2.9回收率试验

采用加样回收法，精密称取2.8中已测定含量的柿叶样品6份，分别精密添加一定量的齐墩果酸及熊果酸对照品，按2.3方法制成供试品溶液，各精密吸取10μL进样，测定齐墩果酸及熊果酸含量，结果见表2。

表2 柿叶中齐墩果酸及熊果酸加样回收试验

2.10样品测定

取10批不同来源的柿叶样品，按上述色谱条件和方法测定齐墩果酸及熊果酸的质量分数，色谱图见图1，测定结果见表3。

A.齐墩果酸及熊果酸对照品 B.柿叶样品1.齐墩果酸 2.熊果酸图1 柿叶及对照品HPLC图

表3 柿叶样品中齐墩果酸及熊果酸的测定/%

3 讨论

经查阅文献[7-8]，齐墩果酸及熊果酸的提取溶剂常用甲醇及乙醇，提取方法可用超声波提取。因此，我们比较了乙醇及不同浓度甲醇的提取效果，结果显示以甲醇提取的含量最高，并通过溶剂加入量和提取时间的考察，确定取样量为1 g时，以甲醇25 mL超声处理(功率240 W，频率40 kHz)30 min的提取效果最佳。

齐墩果酸和熊果酸均为五环三萜类化合物，两者互为同分异构体，性质十分相似，不易分离，我们在研究中分别考察了甲醇-水(85∶15)、甲醇-0.5醋酸铵溶液(85∶15)、乙腈-水(70∶30)、乙腈-甲醇-1.0%醋酸铵溶液(55∶25∶20)等流动相对齐墩果酸及熊果酸的分离效果，结果以流动相乙腈-甲醇-1.0%醋酸铵溶液(55∶25∶20)分离效果最好。

实验所建立的齐墩果酸和熊果酸含量测定方法简单准确、重现性好，可用于柿叶的质量控制。10批柿叶齐墩果酸及熊果酸含量测定的结果显示，齐墩果酸含量较高的样品含熊果酸的量也高，两种成分的含量存在一定的相关性。通过比较自采的5批样品含量测定结果发现，由于采收期的不同，柿叶中齐墩果酸及熊果酸含量存在一定差异，以秋季果实成熟后采收的样品含量较高。

[1] 江西省食品药品监督管理局.江西省中药饮片炮制规范[S].2008版.上海：上海科学技术出版社，2009：212.

[2] 姜红波，赵卫星，冯国栋，等.柿叶的主要有效成分及药理作用研究进展[J].化工时刊，2010，24(6)：38-44.

[3] 林娇芬，林河通，谢联辉，等.柿叶的化学成分、药理作用、临床应用及开发利用[J].食品与发酵工业，2005，31(7)：90-96.

[4] 张明发，沈雅琴.齐墩果酸和熊果酸的抗炎及其变态反应[J].抗感染药学，2011，8(4)：235-240.

[5] 张明发，沈雅琴.齐墩果酸和熊果酸的抗糖尿病药理[J].上海医药，2010，31(8)：347-350.

[6] 张明发，沈雅琴.齐墩果酸和熊果酸的保肝药理研究进展[J].抗感染药学，2012，9(1)：13-19.

[7] 周江煜，侯小涛，黄天静，等.广西产柿叶质量分析研究[J].中药材，2012，35(1)：47-49.

[8] 张兰珍，巴寅颖，季思伟，等.RP-HPLC测定夏枯草不同部位熊果酸和齐墩果酸含量[J].药物分析杂志，2009，29(9)：1547-1549.

SimultaneousDeterminationofOleanolicAcidandUrsolicAcidinKakiFoliumbyHPLC-ELSD

SHENG Xiaojing*，YANG Qun，ZHU Xingyong，ZHANG Xiaoyun

(Jiujiang Institute for Food and Drug Control，Jiujiang 332000，China)

Objective：To establish a high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector(HPLC-ELSD)method for the determination of oleanolic acid and ursolic acid in Kaki folium.Methods：The samples were extracted by methanol and the determination was performed on Waters SunFireTMC18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)with mobile phase consisted of acetonitrile-methanol -1.0% ammonium acetate(55∶25∶20，V/V)at the flow rate of 1.0 mL·min-1and column temperature of 25 ℃，The detection was performed on an evaporative light scattering detector with the drift tube temperature of 90 ℃ and a gas pressure of 0.17 MPa.Results：Oleanolic acid showed a good linear relationship at the range of 0.132 5-1.656 μg(r=0.999 8).The average recovery was 98.86%.Ursolic acid showed a good linear relationship at the range of 0.370 4-4.630 μg(r=0.998 6). The average recovery was 98.88%.Conclusion：The established method is simple and accurate，with good reproducibility，and can be used for quality control of Kaki folium.

Kaki folium；Oleanolic acid；Ursolic acid；HPLC-ELSD；Content determination

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盛晓静，女，副主任中药师，研究方向：中药材及中成药的质量分析；Tel：(0792)8584361-103，E-mail：shengxj11@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.10.005

2014-03-06)