射干药材固体发酵前后6种异黄酮成分含量变化△

张晓瑞，邹桂欣，李国信，尤献民*

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034)

研究开发

射干药材固体发酵前后6种异黄酮成分含量变化△

张晓瑞1，邹桂欣2，李国信2，尤献民2*

(1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳110847；2.辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳110034)

目的：研究射干药材经枯草芽孢杆菌和黑曲霉发酵后其中6种异黄酮成分含量的变化。方法：利用HPLC检测经黑曲霉和枯草芽孢杆菌发酵20d时射干药材中6种异黄酮成分的含量，并与发酵前比较，计算各成分的含量变化。结果：经枯草芽孢杆菌发酵能增加鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的含量，经黑曲霉发酵能增加次野鸢尾黄素的含量。结论：利用枯草芽孢杆菌和黑曲霉发酵后，可使射干药材中苷元成分增加。

射干；枯草芽孢杆菌；黑曲霉菌；固体发酵

射干(Belamcandae Rhizoma)为鸢尾科植物射干Belamcandachinensis(L.)DC.的干燥根茎，含有的异黄酮类成分苷及苷元具有抗炎、止咳等功效[1]，因此提高射干药材中异黄酮苷及苷元的含量也是增加射干药效作用的途径之一。固体发酵是利用微生物代谢过程中产生的酶使底物进行有机反应[2]，在中药中已有广泛的应用，可以将中药的无效成分转化为有效成分[3]，提高中药的药效[4]，减弱中药的毒副作用[5]，促进中药活性成分吸收[6]，为中药组分代谢机制研究提供辅助手段[7]，降低中药的生产成本[8]。目前固体发酵中，黑曲霉和枯草芽孢杆菌得到越来越广泛的应用[9-10]，本文采用固体发酵方法处理射干药材，探讨黑曲霉和枯草芽孢杆菌对射干异黄酮成分的影响，比较射干药材经上述两种微生物固体发酵转化前后的6种有效成分含量变化，为使射干药材得到更有效利用提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1仪器

Aglient1100液相色谱仪(美国Aglient科技公司)，色谱工作站(AgilentChemstation工作站)，FA1004光电分析天平(上海天平仪器厂)，色谱柱：ThenomenexSynergiTolar-RP80A(250mm×4.6mm，4μm)。

1.2材料

乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸为分析纯，娃哈哈纯净水。

射干苷、次野鸢尾黄素对照品(中国食品药品检定研究院，批号分别为111632-200501，111557-200602)；野鸢尾苷、野鸢尾黄素对照品(成都普瑞法科技有限公司，批号分别为13030803，13051402，纯度均大于98%)；鸢尾黄素对照品(成都生物科技有限公司，批号：12081808)；白射干素对照品(自制，高效液相色谱法，纯度大于98.5%)。射干购自河北安国，由辽宁中医药大学生药室李峰教授鉴定为Belamcandachinensis(L.)DC的干燥根茎。实验菌种：枯草芽孢杆菌和黑曲霉(辽宁北方药检科技有限公司，批号分别为63501-2a12，201103)，麦麸(市售)。

2 方法与结果

2.1实验操作

精密称量0.5g射干药材粉末、0.5g麦麸，置于锥形瓶中二者混匀，加5mL水湿润，平行3份，向样品瓶分别接种1mL枯草芽孢杆菌及黑曲霉菌液，浓度分别为105，2×104CFU·mL-1，分别在30～35℃和25～28℃条件下发酵。

2.2射干异黄酮成分测定方法

2.2.1色谱条件ThenomenexSynergiTolar-RP80A色谱柱(250mm×4.6mm，4μm)，流动相A为0.2%磷酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱：0～15min，A为85%～75%；15～25min，A为75%～72%；25～35min，A为72%～65%；35～50min，A为65%～50%。流速：1.0mL·min-1；检测波长：265nm；进样量：20μL，柱温：30℃，典型色谱图见图1。

图1 射干药材真菌发酵前后的HPLC图A.混合对照品 B.黑曲霉菌发酵 C.枯草芽孢杆菌发酵 D.射干药材 E.麦麸1.射干苷 2.野鸢尾苷 3.鸢尾黄素 4.野鸢尾黄素 5.次野鸢尾黄素 6.白射干素

2.2.2对照品溶液制备 精密称取射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素及白射干素对照品各适量，置同一容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，制成含射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素及白射干素的混合对照品溶液，质量浓度分别为0.128，0.170，0.210，0.192，0.072，0.038mg·mL-1。

2.2.3供试品溶液制备 精密称取射干粉末及麦麸各0.5g，置50mL锥形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，称定重量，超声提取30min，放冷，称重，用70%乙醇补足减失的重量，滤过，弃去初滤液，取续滤液备用。

2.2.4线性关系的考察 分别精密吸取混合对照品溶液2，4，6，8，10μL，注入液相色谱仪中，测定。以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，进行线性回归，得各组分的回归方程及相关系数，见表1，各成分线性关系良好。

表1 6种异黄酮类成分线性关系测定结果

2.2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积，射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素及白射干素的RSD分别为0.25%，0.26%，0.24%，0.33%，0.28%，0.34%，结果表明仪器精密度良好。

2.2.6稳定性试验 分别于供试品溶液放置0，2，4，8，12 h时精密吸取20 μL，注入液相色谱仪中，测定，计算RSD，结果射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素及白射干素的RSD分别为0.61%，0.42%，2.2%，0.50%，0.42%，2.9%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 称取射干及麦麸各0.5 g，平行6份，按2.2.3项下制备供试品溶液，测定，射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素及白射干素的质量分数分别为0.47，2.9，1.6，2.3，0.79，0.50 mg·g-1，RSD分别为0.52%，0.48%，2.3%，0.51%，0.46%，2.6%，表明重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取射干粉末0.25 g及麦麸0.5 g，平行6份，分别精密加入混合对照品适量，按供试品溶液处理方法制备样品，测定，进样20 μL，计算加样回收率。射干苷、野鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素及白射干素的平均回收率分别为103.1%，101.5%，103.3%，99.8%，100.3%，99.1%，RSD分别为2.5%，2.8%，1.4%，1.1%，1.2%，2.7%，表明实验准确度良好。

2.3样品测定

于发酵20d时取相应组的药材，分别精密加入70%乙醇25mL，超声提取30min，滤过，精密吸取续滤液20μL，分别注入液相色谱仪中，按2.2.1色谱条件测定。

采用外标法计算不同实验条件各组分的质量分数，以空白组各组分含量为100%，计算各成分变化百分率，结果见图2。

图2 两种真菌固体发酵20 d时射干中6种异黄酮成分的变化

2.4数据分析

由图2可见，枯草芽孢杆菌发酵20d，射干苷、野鸢尾苷、野鸢尾黄素及白射干素的含量有不同程度的下降，但鸢尾黄素及野鸢尾黄素含量有所提高，尤其是鸢尾黄素含量增加了60%。

黑曲霉菌发酵20d，除次野鸢尾黄素含量有增加外，其余5种异黄酮成分均有大幅降低，鸢尾黄素和白射干素几乎检测不到，但能在异黄酮苷及苷元中检测到多个未知成分。

3 讨论

实验中曾经对固体发酵条件进行优选，每个菌种选择3个浓度，分别发酵10，20，30d，结果表明采用中等浓度的枯草芽孢杆菌发酵20d效果最好，可使具有多种药理活性作用的鸢尾黄素及野鸢尾黄素含量显著提高。

由图1-B可见，在黑曲霉菌发酵中，虽然测定的6种异黄酮成分含量损失较大，但也在保留时间20～30min之间产生了一些新的色谱峰，这些新物质的分离鉴定及药效作用正在进一步研究中。

射干药材中的异黄酮成分，尤其是苷元具有抗炎、止咳等多种药理作用，本文研究结果表明，固体发酵可以提高鸢尾黄素和次野鸢尾黄素等苷元的含量，为应用生物转化技术提高射干药材有效成分含量提供了实验依据。

[1] 秦文艳，赵金明，齐越，等.射干提取物体内体外抑菌作用的研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(4)：147-150.

[2]BrownWM.MechanismofevolutioninanimalmitochondrialDNA[J].AnnNYAcadSci，1981，361：119-134.

[3] 汤树良.人肠道菌对人参皂苷的代谢及相关产物的抗变态反应活性[J].国外医学·中医中药分册，2003，25(6)：349.

[4] 郭继强，朱殿生，谭慧.假单胞菌转化喜树碱的初步研究[J].食品科技，2010，35(1)：42.

[5] 唐圆圆，刘谦，张景红.生物技术在雷公藤减毒增效中的应用[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(9)：214.

[6] 肖娟，王莹，王新宏，等.中药化学成分肠道菌群代谢的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(5)：247.

[7] 郭永超，林哲绚，罗文鸿.短刺小克银汉霉菌对马兜铃酸A的代谢转化[J].药物生物技术，2006，13(6)：451.

[8] 彭艳红，张梁，丁重阳，等.重组枯草芽胞杆菌不对称还原产d-伪麻黄碱[J].生物工程学报，2011，27(7)：1082.

[9] 陈箐筠，张迎庆，干信，等.黑曲霉As3.4309发酵转化芦丁的研究[J].2009，19(2)：88-91.

[10] 谷军，张晓彦，原韬，等.生防用枯草芽孢杆菌固态发酵工艺的研究[J].生物技术，2013，23(1)：86-89.

SixKindsofIsoflavoneConstituentofBelamcandaeRhizomaBeforeandAfterSolidFermentation

ZHANG Xiaorui1，ZOU Guixin2，LI Guoxin2，YOU Xianmin2*

(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang110847；China；2.Liaoning Province Institute of TCM，Shenyang110034，China)

Objective：To investigate six kinds of isoflavone constituent of Belamcandae Rhizoma after fermentation byBacillussubtilisandAspergillusniger.Methods：To compare with the content of six kinds of isoflavone before and after(20 days)fermented byB.subtilisandA.niger.The contents were determined by HPLC method.Results：The contents of tectorigenin and irisflorentin can be raised after ferment byB.subtilis，and irisflorentin can be raised after ferment byA.niger.Conclusion：The content of aglycone can be raised，after Belamcandae Rhizoma was fermented byB.subtilisandA.niger.

Belamcandae Rhizoma，Bacillussubtilis，Aspergillusniger，Solid fermentation.

“十二五”国家重大新药创制项目——中药新药临床评价研究技术平台(2012zx09303-017)，国家自然科学基金项目(81273927)，国家中医药管理局临床中药学重点学科

*

尤献民，研究员，研究方向：中药质量控制方法；Tel：(024)86803173，E-mail：youxianmin1120@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.10.003

2014-03-01)