肠道微生物对牛蒡苷的转化及转化酶的初步研究△

姜洪帅，窦德强

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

研究开发

肠道微生物对牛蒡苷的转化及转化酶的初步研究△

姜洪帅，窦德强*

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

目的：研究人肠内细菌对牛蒡苷48 h的转化和转化酶的性质。方法：采用人肠内细菌的混合菌液与牛蒡苷在37 ℃厌氧条件下进行培养；采用硅胶柱色谱和制备HPLC分离转化产物；根据核磁共振波谱鉴定转化产物的结构；采用超声破碎方法，提取人肠内细菌总酶。结果：牛蒡苷在48 h内可被人肠内细菌转化为牛蒡苷元和牛蒡苷元脱甲基化产物；转化酶可能为组成酶和诱导酶。结论：牛蒡苷在48 h时主要转化产物为牛蒡苷元和脱甲基化产物。

牛蒡苷；人肠内细菌；生物转化；酶

中药主要以传统水煎液口服的方式使用，因此中药有效成分的转化吸收和代谢主要发生在胃肠道和肝脏。人体的消化道中寄居着100多种微生物，数量一般为1012～1014个，微生物的种群和数量影响着人体的健康，有学者将肠道内具有调控代谢和化学转化能力的微生物群落作为人体的一个新器官[1]。微生物在体内寄居时，产生和分泌多种酶类，在维持微生物自身新陈代谢的同时，对经过胃肠道的食物和药物进行酶催化性生物转化，进而帮助摄入食物和药物的转化和吸收。酶催化的化学反应具有效率高、区域选择性和立体选择性强、副产物少、反应条件温和等特点[2]。牛蒡子作为传统中药被广泛使用，牛蒡苷为其主要的木脂素类成分，目前报道牛蒡苷药理作用的文献不多，而牛蒡苷元作为其水解产物具有多方面牛蒡苷所没有的药理作用，甚至在某些方面药理作用比牛蒡苷更强[3]。Li等利用人和鼠的肠道微生物在体外厌氧转化的方法，发现牛蒡苷通过水解、脱甲基、脱羟基的过程，经过7 d最终转化为动物木脂素肠内酯[4]。然而口服的药物，在胃肠道中消化和吸收的时间最长为72 h，一般在体内停留时间为48 h，因此在体外研究胃肠道微生物对药物的转化试验中，一般考察微生物对药物的48 h转化，延长微生物对药物在体外的转化时间，只有微生物在体外转化意义而没有药物在体内胃肠道中的微生物转化意义[5]。因此本实验通过考察48 h内牛蒡苷在体外的转化情况，来推测牛蒡苷在体内胃肠道的代谢情况，为寻找牛蒡苷在体内发挥药效的真正活性成分奠定基础。

1 仪器与试药

牛蒡苷(实验室自制，纯度≥98%)；厌氧液体培养基(北京陆桥技术有限责任公司)；甲醇(天津市登科化学试剂有限公司)；三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司)；正丁醇(天津市进丰化工有限公司)；甲醇(美国TE-DIA公司)。

Agilent 1260型高效液相色谱系统(美国安捷伦Agilent科技公司)；HPP-9272电热恒温培养箱(北京东联哈尔仪器制造公司)；DL-CJ-1N型垂直层流单人标准操作台；MLS-3780高压蒸气灭菌锅(杭州亚旭生物科技有限公司)；KQ-250DE台式数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 人肠内细菌对牛蒡苷的转化及产物的分离和鉴定

2.1.1 人肠内混合菌液的制备 收集脾胃功能正常的健康志愿者排出的新鲜粪便(3个月内没有服用过抗菌药)，装入反复多次充满氮气的自封袋内，加入重量与体积比为1∶1的已灭菌的厌氧肉汤培养基，用手挤压，使粪便均匀化，孔径为1 mm纱布过滤，得到人肠内细菌的混合液。

2.1.2 牛蒡苷在混合菌液中的转化 吸取上述混合菌液体积的1/10，加入10倍量的培养基和50 mg的牛蒡苷，放入保干器内，通过烛缸法和焦性没食子酸化学吸氧法除去容器中的氧气，当厌氧指示剂试纸显示白色后表明达到厌氧状态。将保干器放入恒温培养箱内，在37 ℃下厌氧培养48 h。

2.1.3 转化产物的分离和鉴定 向48 h的转化液中加入等体积的正丁醇(水饱和，0.1%乙酸酸化)，摇匀，4 000 r·min-1离心30 min，分层，反复萃取离心3次，合并正丁醇层，旋转蒸干，硅胶柱色谱CHCl3-CH3OH(100∶0→100∶1)梯度洗脱，制备HPLC纯化，得到化合物2和3。

化合物2：无色针状结晶，通过HPLC图和TLC法与牛蒡苷元对照品比较，确定化合物2为牛蒡苷元。

化合物3：棕色粉末状固体，13C-NMR(CDCl3，500 MHz)：179.5(C-1)，46.5(C-2)，41.0(C-3)，71.6(C-4)，130.6(C-1′)，116.2(C-2′)，144.0(C-3′)，142.9(C-4′)，115.3(C-5′)，121.6(C-6′)，34.2(C-7′)，130.6(C-1")，112.0(C-2")，149.1(C-3")，147.9(C-4")，111.5(C-5")，120.8(C-6")，38.2(C-7")，56.0，55.9(-CH3×2)。通过与文献[4]数据比较，确定化合物3为牛蒡苷元脱甲基产物。

根据化合物2和3的结构，推断牛蒡苷的转化路径如图1所示。

采用HPLC监测牛蒡苷的转化过程，色谱柱为Agilent ZORBAX-SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(46∶54)，检测波长为280 nm，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30 ℃。牛蒡苷转化的HPLC图见图2。

图1 人肠内细菌对牛蒡苷的生物转化路径

1.牛蒡苷 2.牛蒡苷元 3.3″-去甲基牛蒡苷元A.粪便空白溶液 B.牛蒡苷起始转化溶液 C.牛蒡苷48 h转化溶液图2 牛蒡苷转化的HPLC图

2.2 人肠内微生物粗酶的提取及对牛蒡苷的转化

取40 g新鲜粪便，按照质量与体积比为1∶5加入4 ℃、pH 7.2的缓冲溶液，孔径为1 mm的纱布过滤，制备粪便混悬液。取50 mL滤液在冰浴条件下，200 W超声破碎细胞，超声3 s，停3 s，在4 ℃、10 000 r·min-1条件下离心10 min，收集上清液，作为总酶。向总酶溶液中加入50 mg的牛蒡苷，置于37 ℃下转化48 h。另取50 mL粪便混合液，加入50 mg的牛蒡苷，在37 ℃厌氧条件下转化48 h，作为与总酶转化的对照。分别取48 h的总酶转化液和粪便混合液的转化液萃取离心、点板，三氯化铁试剂显色。结果表明总酶转化液只有1种转化产物，为牛蒡苷元；粪便混合液存在两种转化产物，分别为牛蒡苷元和牛蒡苷元脱甲基化产物。

3 讨论

通过牛蒡苷在体外的48 h转化实验，发现牛蒡苷可以全部转化成牛蒡苷元，而牛蒡苷元有部分转化为化合物3，这与存在的转化酶的性质有一定的联系。在总酶提取液中，可以使牛蒡苷水解为牛蒡苷元，说明水解酶可能是一种人体胃肠道分泌的消化酶，也可能是微生物体内的一种组成酶，而在微生物超声破碎以后，微生物死亡，总酶释放到溶液中，而总酶并不能对牛蒡苷元进行转化，由此可以说明脱甲基酶是微生物的一种诱导酶，需要底物牛蒡苷元诱导一段时间后活体微生物才会产生，进而催化转化的进行。从48 h的结果分析，牛蒡苷转化成牛蒡苷元非常完全，牛蒡苷元脱甲基转化不完全，说明脱甲基过程是控制转化的限速步骤。牛蒡苷在体内发挥药效的物质基础可能是牛蒡苷元和牛蒡苷元脱甲基化转化产物。

[1] 刘开朗，王佳启，卜登攀，等.人体肠道微生物多样性和功能研究进展[J].生态学报，2009，30(5)：2589-2594.

[2] Ma B P，Feng B，Huang H Z，et al.Biotransformation of Chinese herbs and their ingredients[J].Mode Tradit Chin Med Mater Med，2010，12(2)：150-154.

[3] 王潞，赵烽，刘珂.牛蒡子苷及牛蒡子苷元的药理作用研究进展[J].中草药，2008，39(3)：467-470.

[4] Xie L H，Ahn E M，Akao T，et al.Transformation of arctiin to estrogenic and antiestrogenic substances by human intestinal bacteria[J].Chem Pharm Bull，2003，51(4)：378-384.

[5] 杨秀伟，徐嵬.中药化学成分的人肠内细菌生物转化模型和标准操作规程的建立[J].中国中药杂志，2011，36(1)：19-26.

The Biotransformation of Arctiin by Human Intestinal Bacteria and Enzymes

JIANG Hongshuai，DOU Deqiang*

(CollegeofPharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China)

Objective：To study the biotransformation of arctiin by human intestinal flora(HIF)within 48 h and the characteristics of transformation enzymes.Methods：The arctiin was anaerobically incubated with HIF at 37 ℃ for 48 h.The biotransformation products were isolated and purified by silica gel column chromatography and prepared HPLC.Chemical structures of the transformed products were determined by nuclear magnetic resonance(NMR)method.The enzymes of HIF were extracted by ultrasonication.Results：Arctiin was converted to arctigenin and 3″-demethylarctigenin.Its transform enzymes were probably constitutive enzymes and induced enzymes.Conclusion：The main biotransformation products of arctiin were arctigenin and 3″-demethylarctigenin within 48 h.

Arctiin；Human intestinal bacteria；Biotransformation；Enzyme

沈阳市科学计划项目(F11-264-1-20)；辽宁省高等学校创新团队项目(LT2013020)

*[通信作者] 窦德强，教授，博士生导师，研究方向：中药药效(性)物质基础及新药开发研究；Tel：(0411)87406497，E-mail：deqiangdou@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.003

2013-09-13)