HPLC测定戊己丸中4种生物碱类成分的含量△

李俊健，吴永成，宋粉云

(广东药学院 药科学院，广东 广州 510006)

HPLC测定戊己丸中4种生物碱类成分的含量△

李俊健，吴永成，宋粉云*

(广东药学院 药科学院，广东 广州 510006)

目的：建立测定戊己丸中4种生物碱类成分含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法，固定相为Diamonsil-C18柱，乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(48∶52)(每100 mL中加入十二烷基硫酸钠0.4 g)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为284 nm，柱温为25 ℃。结果：盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀分别在5.0～50.0，0.4～4.0，2.0～20.0，2.0～20.0 g·mL-1呈良好的线性关系；平均回收率分别为102.4%，100.1%，100.0%，102.0%；方法精密度RSD分别为0.36%，1.50%，1.60%，0.86%(n=6)。结论：该法可用于戊己丸的质量控制。

戊己丸；盐酸小檗碱；盐酸表小檗碱；盐酸黄连碱；盐酸巴马汀；反相高效液相色谱法；含量测定

戊己丸是由黄连、吴茱萸(制)、白芍(炒)3味中药制成的中药成方制剂，具有泻肝和胃，降逆止呕之功效。临床用于肝火犯胃、肝胃不和所致的胃脘灼热疼痛、呕吐吞酸、口苦嘈杂、腹痛泄泻等症的治疗。其现行标准采用HPLC测定盐酸小檗碱和芍药苷的含量[1]。已有HPLC测定盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、吴茱萸碱和吴茱萸次碱等含量的报道[2-5]，但同时测定盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀的含量测定未见文献报道。黄连为方中主药，其主要成分为生物碱[6]，其中盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀为《中国药典》2010年版黄连含量测定指标成分[1]。为进一步评价戊己丸的质量，笔者建立了戊己丸中盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀4种生物碱类成分含量测定的反相高效液相色谱法，具有分离效果好、灵敏、准确等优点，可用于该制剂的质量控制。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪(安捷伦公司)，Agilent 1100系列双元泵，Agilent 1100可变波长检测器，Agilent 1100/化学工作站；KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，工作频率100 kHz，输出功率400 W。

盐酸小檗碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110713-200609)，盐酸表小檗碱对照品(上海华壹生物科技有限公司，经峰面积归一化法测定[1]，含量为98.2%)，盐酸黄连碱对照品(上海华壹生物科技有限公司，经峰面积归一化法测定[1]，含量为98.3%)，盐酸巴马汀对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110732-201108)；戊己丸(李时珍医药集团有限公司，批号：201102001，201009007，201109008)。乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为双蒸水。

2 方法与结果

2.1 样品液制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品12.5 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为250 μg·mL-1的盐酸小檗碱对照品贮备液。精密称取盐酸黄连碱对照品10.2 mg、盐酸巴马汀对照品10.0 mg，分别置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得盐酸黄连碱、盐酸巴马汀质量浓度分别为100，100 μg·mL-1的对照品贮备液。精密称取盐酸表小檗碱对照品5.1 mg置250 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得盐酸表小檗碱质量浓度为20.0 μg·mL-1的对照品贮备液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约0.05 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇(1∶100)溶液50 mL，密塞，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液0.45 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.1.3 阴性对照品溶液的制备 取处方组成中除黄连外的其余成分制成不含黄连的阴性对照品，按2.1.2项下的制备方法处理得阴性对照液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱为Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪马公司)，乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾(48∶52)(每100 mL加0.4 g十二烷基硫酸钠)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为284 nm，柱温为室温。分别取对照品溶液(盐酸小檗碱质量浓度为20.0 μg·mL-1、盐酸表小檗碱质量浓度为1.6 μg·mL-1、盐酸黄连碱质量浓度为8.0 μg·mL-1、盐酸巴马汀质量浓度为8.0 μg·mL-1)、供试品溶液和阴性对照溶液10 μL注入液相色谱仪，理论板数以盐酸小檗碱峰计算应不低于5 000，盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱保留时间分别为20.0，22.7，26.5，30.8 min，与其他组分峰的分离度大于1.5；阴性样品不干扰样品测定，见图1。

1.盐酸表小檗碱 2.盐酸黄连碱 3.盐酸巴马汀 4.盐酸小檗碱A.对照品 B.样品 C.阴性对照品图1 戊己丸及对照品HPLC图

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线制备 分别吸取一定量的对照品贮备液，加甲醇稀释成盐酸小檗碱质量浓度为5.0，10.0，20.0，40.0，50.0 μg·mL-1，盐酸表小檗碱质量浓度为0.4，0.8，1.6，3.2，4.0 μg·mL-1，盐酸黄连碱质量浓度为2.0，4.0，8.0，16.0，20.0 μg·mL-1，盐酸巴马汀质量浓度为2.0，4.0，8.0，16.0，20.0 μg·mL-1的系列对照品溶液。依次进样10 μL，每个浓度测定3次以上。以峰面积(Y)对对照品溶液系列质量浓度(X)进行回归，得盐酸小檗碱回归方程Y=20.69X-7.13，r=0.999 9；盐酸表小檗碱回归方程Y=63.27X+0.26，r=0.999 7；盐酸黄连碱回归方程Y=20.24X-4.11，r=0.999 8；盐酸巴马汀回归方程Y=28.20X-4.20，r=0.999 9。表明盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀分别在5.0～50.0,0.4～4.0,2.0～20.0,2.0～20.0 μg·mL-1与峰面积线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 取盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀质量浓度分别为20.0，1.6，8.0，8.0 μg·mL-1的对照品溶液10 μL，连续测定5次，其峰面积的平均值分别为401.5，103.0，157.1，220.0，RSD分别为1.06%，1.54%，0.75%，1.59%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号：201102001)在0，2，4，6，8，12 h 分别进样10 μL，记录峰面积，结果盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀峰面积的平均值分别为639.0，114.5，156.1，171.6，RSD分别为1.83%，1.86%，1.58%，1.77%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.4 重复性试验 取同一批号(批号：201102001)样品6份，按2.1.2方法提取、测定，结果盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀的平均含量分别为29.391，1.716，7.412，5.932 mg·g-1，RSD分别为0.36%，1.50%，1.60%，0.86%，表明分析方法精密度良好。

2.3.5 加样回收试验 精密称取同一批号样品(批号：201102001)约0.025 g共6份，加入相应量的4种对照品贮备液，按2.1.2方法处理并测定，计算盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀的回收率，结果表明本方法准确可靠。见表 1～4。

2.4 样品含量测定

取戊己丸样品3批，照2.1.2方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，计算样品中4种生物碱类成分的含量，结果见表5。

表1 戊己丸中盐酸小檗碱回收率试验

表2 戊己丸中盐酸表小檗碱回收率试验

表3 戊己丸中盐酸黄连碱回收率试验

表4 戊己丸中盐酸巴马汀回收率试验

表5 戊己丸中样品含量测定(n=3) /mg·g-1

3 讨论

黄连及其制剂中生物碱类成分的提取溶剂一般为盐酸-甲醇[1]，笔者参照文献报道的戊己丸中盐酸小檗碱提取方法[1]，以盐酸-甲醇(1∶100)为溶剂进行提取，比较了加热回流与超声提取对提取率的影响，并考察了超声提取时间对提取的影响，最终确定超声提取30 min，本法简单、提取率高。

黄连及其制剂中生物碱类成分的HPLC含量测定，检测波长主要采用345 nm和265 nm[1]。经考察发现，在上述波长下干扰较大，在284 nm下，4种生物碱的吸收都比较大，而且干扰小，故选择284 nm作为检测波长。

黄连中生物碱属于季铵碱，因此其测定采用离子对色谱法，流动相中加入离子对试剂十二烷基硫酸钠，参照文献[1，7-8]考察了乙腈和磷酸二氢钾的比例及十二烷基硫酸钠的加入量对分离的影响，发现乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾(48∶52)(每100 mL加0.4 g十二烷基硫酸钠)为流动相分离效果最好。

笔者采用离子对反相高效液相色谱法测定戊己丸中4种生物碱的含量，方法学验证表明，其精密度、准确度、重复性均能满足定量的要求，故本方法可用于戊己丸的质量控制。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：637-638，285-286，463-464.

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Determination of 4 Kind Alkaloids in Wuji Wan by HPLC

LI Junjian，WU Yongcheng，SONG Fenyun*

(SchoolofPharmacy，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China)

Objective：To establish a method for the determination of 4 kind alkaloids in Wuji Wan.Methods：HPLC method was established.The chromatographic column was Diamonsil-C18.The mobile phase was a mixture of acetonitrile-0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate(48∶52，V/Vcontaining 0.4 g sodium laurylsulfate per 100 mL).The flow rate was 1.0 mL·min-1，and the detection wavelength was 284 nm.Results：The calibration curves for berberine hydrochloride，epiberberine hydrochloric，coptisine hydrochloride，palmatine hydrochloride were linear in the concentration range of 5.0-50.0，0.4-4.0，2.0-20.0，2.0-20.0 g·mL-1，respectively.The average recoveries for berberine hydrochloride，epiberberine hydrochloric，coptisine hydrochloride，palmatine hydrochloride were 102.4%，100.1%，100.0%，102.0%，respectively.Precision of the method was 0.36%，1.50%，1.60%，0.86%(RSD，n=6)，respectively.Conclusion：The method can be used for quantitative determining of Wuji Wan.

Wuji Wan；Berberine；Epiberberine；Coptisine；Palmatine；RP-HPLC；Quantitative determining

广东省自然科学基金项目(5002841)

*[通信作者] 宋粉云，教授，硕士生导师，研究方向：现代分析方法在中药质量控制中的应用研究；E-mail：fuhaiwu@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.014

2013-05-15)