不同种源太子参中多糖和氨基酸含量的比较研究△

杨昌贵，江维克*，周 涛，肖承鸿，艾强，张代金

(1.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002；2.贵州三元太宝实业有限公司，贵州 施秉 556200)

不同种源太子参中多糖和氨基酸含量的比较研究△

杨昌贵1，江维克1*，周 涛1，肖承鸿1，艾强1，张代金2

(1.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002；2.贵州三元太宝实业有限公司，贵州 施秉 556200)

目的：通过对9个太子参种源的多糖和17种氨基酸含量进行测定，考察同一种源在不同环境和不同管理模式下多糖和氨基酸含量变化，研究影响太子参质量的主要因素。方法：采用显色比色法测定多糖含量，采用柱前衍生化-HPLC法测定17种氨基酸含量。结果：太子参9个种源间药材的多糖含量差异比较大，其中贵州施秉逸生种源和安徽种源的多糖含量超过50%。太子参9个种源间药材的总氨基酸和人体必需氨基酸含量差异不大，不同的氨基酸在不同种源中的含量差异却较大，其中精氨酸和天门冬氨酸在不同种源药材中的含量均较高，9个种源药材中的平均含量分别为2.49%和1.41%。结论：多糖含量可以作为太子参种源筛选、栽培环境和管理方式考察的指标；太子参中氨基酸含量主要与繁殖方式有关。

太子参；种源；多糖含量；氨基酸含量

太子参为石竹科Caryophyllaceae植物孩儿参Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根，具有益气健脾、生津润肺之功效[1]。现代化学与药理研究表明，太子参中含有三萜皂苷、多糖等化学成分，具有改善慢性心衰、改善记忆、降糖、抗氧化等药理作用[2-6]。

自20世纪90年代初贵州施秉县从福建柘荣县成功引种了太子参后，在施秉及其周边地区逐渐形成了规模种植，随着太子参保健食品的开发利用，贵州太子参的种植规模也在不断扩大。近30年来，由于各种植企业和种植户相继从安徽、江苏、福建等地区引进了10多批栽培和野生种源，造成施秉太子参种源混杂，质量参差不齐。选择合适、优良的种质资源进行种植，可以从源头上保证太子参药材的品质。

本文在前期研究太子参不同栽培类型、不同繁殖方式、不同采收期生物量次生代谢产物的动态变化规律[7-8]和建立太子参种质资源圃的基础上，以多糖和氨基酸含量为营养成分指标，对9个太子参种源进行检测比较，同时考察同一种源在不同环境和管理下的营养组分的含量变化，旨在为太子参种植中选择适宜种源提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

9个种源的太子参样品采集自2012年7月于贵州省施秉县“贵州三元太宝实业股份有限公司”的太子参种质资源圃(海拔946 m，N 27°08′21.0″，E 107°56′0.10″)。同时以2、5、7号种源为实验对象，分别考察同一种源在人工管理与自然逸生条件、大田开旷与林下阴蔽环境、有性与无性种植后药材多糖与氨基酸含量的差异水平。每份材料分别采集10株块根，洗净，≤ 50 ℃烘干，混合粉碎，备用。

表1 实验材料信息

1.2 仪器和试剂

紫外可见分光光度计(CBC Cintra20型，澳大利亚照生公司)；高效液相色谱仪(日本岛津LC-20AD)；电子分析天平(EL-104型，梅特勒-托利多仪器有限公司)。葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110833-200904)；氨基酸测定试剂包(天津博纳艾杰尔科技有限公司，包括：三乙胺，异硫氰酸苯酯，正亮氨酸)，氨基酸标准溶液(天津博纳艾杰尔科技有限公司，含17种氨基酸，除胱氨酸为1.25 μmol·mL-1外，其余氨基酸都是2.5 μmol·mL-1)；乙腈(色谱纯，Dikma Technologies INC.美国)；无水乙醇、盐酸、浓硫酸(分析纯，上海申博化工有限公司)。

2 方法

2.1 太子参中多糖测定的方法

2.1.1 标准曲线的制作 精密称取无水葡萄糖对照品，加蒸馏水制成浓度为44.36 μg·mL-1、35.488 μg·mL-1、26.616 μg·mL-1、17.744 μg·mL-1、8.872 μg·mL-1的对照品溶液，分别取2 mL，依次加入苯酚溶液1 mL、浓硫酸5 mL，加热15 min，冰浴10 min，室温下于490 nm波长下测定。以吸光度A为纵坐标，浓度X为横坐标，得回归方程：A=0.06X+0.050 1，r=0.999 7。

2.1.2 样品溶液的制备 精密称取样品粗粉0.1 g，用80%乙醇提取1 h，药渣用蒸馏水90 ℃提取1 h，过滤，药渣加蒸馏水洗涤数次，洗液并入滤液，蒸馏水定容于100 mL。再取50 mL加蒸馏水定容于100 mL备用。

2.1.3 多糖的含量测定 精密吸取样品溶液0.5 mL，加蒸馏水至2.0 mL；吸取两个不同浓度的对照品溶液2.0 mL，按2.1.1项下，自“依次加入1.0 mL苯酚试液”起操作，并按多糖含量(%)=[(0.0607A-0.0001)× f/W]×100计算。A为样品测定吸光度平均值，W为样品称样量(g)，f为多糖换算因子(f=2.38)。结果见表5、图2。

2.1.4 精密度测定 精密吸取对照品溶液2.0 mL，按2.1.1项下，测定6次，吸光度的RSD 为0.08%，说明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性实验 精密称取样品0.1 g，照2.1.2和2.1.3项下操作，分别于0，30，60，90，150 min测定吸光度。结果RSD值为3.14%，说明在150 min内样品具有良好的稳定性。

2.1.6 重复性实验 精密称取同一样品5份，每份0.1 g，照2.1.2和2.1.3项下，测定吸光度。结果RSD值为3.21%，说明方法的重复性良好。

2.1.7 加样回收实验 精密称取同一产地6份样品，每份0.05 g，加入适量葡萄糖对照品，照2.1.2和2.1.3项下，测定吸光度。计算结果见表2。

表2 太子参中多糖成分的加样回收率试验

2.2 氨基酸的含量测定

2.2.1 色谱条件 VenusilAA氨基酸分析专用柱(4.6×250 mm，5 μm，柱号：AA952505-0)；以醋酸钠水溶液为流动相A，以80%乙腈水溶液为流动相B，按表3进行梯度洗脱；检测波长为254 nm；柱温为40℃；流速为1.0 mL·min-1。见图1。

表3 太子参氨基酸成分的梯度洗脱条件表

A.对照品 B.样品 1.天门冬氨酸(Asp) 2.谷氨酸(Glu) 3.丝氨酸(Ser) 4.甘氨酸(Gly) 5.组氨酸(His) 6.精氨酸(Arg) 7.苏氨酸(Thr) 8.丙氨酸(Ala) 9.脯氨酸(Pro) 10.酪氨酸(Tyr) 11.缬氨酸(Val) 12.蛋氨酸(Met) 13.胱氨酸(Cys) 14.异亮氨酸(Ile) 15.亮氨酸(Leu) 16.正亮氨酸(Nle，内标物) 17-苯丙氨酸(Phe) 18赖氨酸(Lys)图1 太子参氨基酸高效液相色谱图谱

2.2.2 样品处理 取样品粉末0.5 g，精密称定，置安瓿瓶中，精密加入0.1%苯酚的6 moL·L-1盐酸10 mL，110 ± 1 ℃水解24 h，取出过滤，取滤液5 mL蒸干，残渣加蒸馏水5.0 mL溶解，用0.45 μm滤膜过滤后，备用。

2.2.3 衍生化反应 精密量取氨基酸标准溶液及样品溶液2.0 mL，加正亮氨酸内标溶液0.20 mL，三乙胺乙腈溶液1 mL、异硫氰酸苯酯乙腈溶液1.0 mL，室温放置3 h，然后加入正己烷4.0 mL，放置10 min，取下层溶液，用0.45 μm滤膜过滤，取滤液2.0 mL，加水定容至10 mL，即得。2.2.4 测定 精密吸取对照品溶液、供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪测定。氨基酸含量(%)=f1C V×10-4/f2W。f1=样品溶液中各氨基酸峰面积/内标物峰面积；f2=氨基酸标准溶液中各氨基酸峰面积∕内标物峰面积；C=氨基酸对照品浓度(μg·mL-1)，V=样品溶液定容体积，W=样品质量(g)。结果见表5、图3。

2.2.5 线性关系考察 分别取混合氨基酸标准溶液100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL、350 μL、400 μL按2.2.3和2.2.4项下测定。以各氨基酸峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标，进行线性回归。除胱氨酸在0.125～0.500 μmoL·mL-1外，其余氨基酸在0.25～1.00 μmoL·mL-1范围内呈良好的线性关系。17种氨基酸的线性回归方程及其相关系数r值见表4。

表4 17种氨基酸的线性回归方程及r值

2.2.6 精密度测定 取氨基酸对照品溶液，连续进样5次，记录色谱图。计算各氨基酸的峰面积，结果RSD为1.72%～4.02%，表明精密度良好。

2.2.7 重现性试验 取同一样品5 份，精密称定，按2.2.2和2.2.3 项下处理后测定，计算各氨基酸的峰面积，结果RSD值为0.75%～3.01%，重现性良好。

2.2.8 稳定性试验 取衍生后的样品溶液，放置0，2，4，6，8，10，12 h，分别测定，计算各氨基酸的峰面积，结果RSD值为1.08%～2.94%，说明样品至少在12 h 内稳定。

2.2.9 加样回收率试验 称取已知含量的太子参粉末0.25 g，按2.2.2、2.2.3项方法分别提取、衍生、进样，平行5次，计算各氨基酸的回收率。结果，17种游离氨基酸的平均回收率在86.25%～108.04%之间，RSD值在1.24%～2.93%之间。

表5 不同种源太子参中多糖和氨基酸的含量 /%

注：*人体必需氨基酸；**总氨基酸含量为以上各氨基酸含量之和

图2 不同种源太子参多糖含量均值比较图

图3 不同种源太子参总氨基酸含量均值、必需氨基酸含量均值比较图

3 结果与讨论

药用植物中的多糖类化合物具有多种药理作用和生理活性，可作为滋补类中药的质量评价指标，有研究认为多糖的含量与药材表面颜色、饱满度有一定相关性[9，10]，多糖含量高的药材性状饱满、光亮。本文测定的9个种源太子参块根中的多糖含量为18.38%～64.95%，RSD值达到31.84%，表明种源间药材中多糖含量的差异比较大。其中SB-02(贵州施秉，逸生)、SB-03(贵州施秉，栽培)和XZ-01(安徽宣州，栽培)多糖含量超过50%，明显高于其他种源的多糖含量。说明尽管施秉不是太子参的传统产地，也没有野生太子参分布的记载，但现在市场上施秉太子参药材品相得到广泛认可，可能与其多糖含量高有关；同时也说明施秉逸生和安徽种源是太子参良种筛选的潜在材料。

本文以SB-02(贵州施秉，逸生)植株和SB-03(贵州施秉，大田)植株为例，考查了同一种源在不同管理模式下块根中多糖含量的变化，结果发现，SB-03(贵州施秉，大田)块根不仅多糖含量高于SB-02(贵州施秉，逃逸)，而且块根数与植株形态远甚于自然生境中的样本，表明科学的人工管理可大幅促进太子参多糖成分的积累和提高产量；以JR-03(江苏句容，林下)与JR-02(江苏句容，大田)种源为例，考查了同一种源引种后在不同生境中的多糖含量变化，结果显示处于较遮阴环境的JR-04样本的多糖含量不仅明显高于开阔生境的JR-02样本，而且生长期延长，倒苗时间较后者植株延后约12～15 d。林光美等人研究认为[11]，适当的遮阴能够延长太子参植株的生长期，可提高种植产量10%，本文的实验和检测结果与之一致，说明生境的适宜程度能影响太子参产量和质量，比如适当的遮阴能够增加植株多糖的积累；本文还发现XZ-02(安徽宣州，有性繁殖)有性繁殖块根的多糖含量比XZ-01(安徽宣州，无性繁殖)无性繁殖块根的略低，但差别不显著，表明不同繁殖材料都是适于人工种植方式的。

氨基酸是动植物体内合成生物蛋白质的主要原料，也是主要的营养成分，某些氨基酸还能够参与机体内的代谢，在基因表达控制方面和激素一样起着重要的作用。由于大多数氨基酸缺乏天然的紫外或荧光吸收，衍生色谱法测定氨基酸的含量已经成为一种趋势，利用异硫氰酸苯酯(PITC)和氨基酸的衍生反应，生成稳定的产物苯基硫酸盐(PTC)-氨基酸，是柱前衍生化测定氨基酸含量的最具有吸引力的分析方法之一[12，13]。由于衍生化反应时间对于测定的稳定性有较大影响，本实验对衍生化反应时间进行了试验，结果表明，衍生化时间应大于2.5 h，本文测定时的衍生化反应时间规定为3 h。

本文测定的9个种源12份材料的17种氨基酸，其中人体必需氨基酸8种。结果显示，9个种源药材的总氨基酸的含量为9.66%～11.95%，RSD值5.81%，人体必需氨基酸(8种)含量为3.19%～4.11%，RSD值7.69%，表明种源间总氨基酸和必需氨基酸含量差异不大。但17种氨基酸在9个种源12份材料中的含量差异大小不一，RSD值从4.10%至32.17%。同时，在考察不同生境对同一种源影响时，发现SB-02(贵州施秉，逸生)和SB-03(贵州施秉，大田)、JR-03(江苏句容，大田)和JR-04(江苏句容，林下)这2种种源中17种氨基酸总含量和必须氨基酸的含量也基本一致，即同一种源的氨基酸类组分与含量受生态环境的影响不大。但考查同一种源不同繁殖方式的氨基酸含量水平，结果显示XZ-02(安徽宣州，有性繁殖)的氨基酸的含量要高于XZ-01(安徽宣州，无性繁殖)。提示太子参氨基酸含量与种源和环境的关系不大，而与繁殖方式有一定的关系。比较有性繁殖和无性繁殖的植株生长过程发现，有性繁殖幼苗较无性繁殖幼苗弱，两种繁殖方式的植株生长后期逐渐趋于一致，而最后产量相当，提示有性繁殖种苗在生长过程中应该有较高的生理代谢活动，因此氨基酸的含量较高。至于再利用F1块根进行无性繁殖后，氨基酸含量是否会降低，有待于进一步的观察。

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Comparative analysis of polysaccharide and amino acid content in different provenances of Pesudostellaria heterophylla from Guizhou Province

YANG Changgui1，JIANG Weike1*，ZHOU Tao1，Xiao Chenghong，AI Qiang，ZHANG Daijin2

(1.GuiyangcollegeofTraditionalChineseMedicine，Guiyang550002，China；2.GuizhouSanyuanTaibaoCo.，Ltd.，Shibing556200，China)

Objective：To study the main influence factors of Pseudostellariae Radix quality by determining polysaccharide and amino acid inPesudostellariaheterophyllafrom 9 different provenances and cultivation way.Methods：The determination of polysaccharide used colorimetric method，the content of 17 kinds of amino acid used pre-column derivatization RP-HPLC method.Results：The contents of polysaccharide in the 9 different provenances had great difference，but the contents of amino acid had little difference.Conclusion：The contents of polysaccharide could be used as the best selection standards forP.heterophyllabreeding.

Pesudostellariaheterophylla；Provenances；Polysaccharide content；Amino acid content

施秉中药材产业科技合作专项计划(施科合专项(20010)02号、(2012)04号)；贵州省教育厅自然科学项目(黔教科(2011)031号)；中央本级重大增减支项目(20603020120，20603020223)；贵阳市科技计划项目(筑科合同[2011201]大—3号、[2012]3号)；贵阳中医学院研究生教育创新计划项目(ZYYCX11033)

*[通信作者] 江维克，教授，研究方向：中药资源、中药栽培及中药质量评价，Tel：(0851)5622506，E-mail：jwk_88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.010

2013-05-20)