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升血调元颗粒的质量标准研究

2014-09-26袁春平林碧珊吴洁莹黄掌欣

中国现代中药 2014年8期
关键词:薄层药材黄芪

袁春平,林碧珊,吴洁莹,黄掌欣

(广东环球制药有限公司,广东 顺德 528303)

升血调元颗粒的质量标准研究

袁春平,林碧珊,吴洁莹,黄掌欣*

(广东环球制药有限公司,广东 顺德 528303)

目的:建立升血调元颗粒的质量标准。方法:采用薄层色谱法对制剂中骨碎补、制何首乌、黄芪及佛手进行定性鉴别;采用高效液相色谱法对制剂中柚皮苷进行含量测定。结果:样品薄层色谱中,骨碎补、制何首乌、黄芪及佛手的薄层色谱斑点清晰,分离效果较好,且阴性无干扰;含量测定中柚皮苷在0.12~1.2 μg呈良好的线性关系(r=0.999 9),平均回收率为100.47%,RSD=1.6%(n=5)。结论:实验方法结果准确可行,重复性好,可作为升血调元颗粒的质量标准,为该制剂的质量控制和标准提升提供科学依据。

升血调元颗粒;质量标准;薄层色谱法;高效液相色谱法

升血调元颗粒是在升血调元汤的基础上更改剂型而来,升血调元汤收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂》第七册,是由鸡血藤、骨碎补、制何首乌、黄芪、麦芽、女贞子、党参、佛手8味中药组成,具有益气养血,补肾健脾的功能,其中党参、黄芪具有补气健脾的功效;骨碎补、何首乌补肾益髓;鸡血藤、女贞子滋阴补血;麦芽、佛手起健脾、舒肝、和胃之效。升血调元颗粒能明显促进BMT小鼠的骨髓造血干细胞数量的恢复和免疫功能的重建,临床上主要用于提升外周血白细胞和其他原因引起的白细胞减少症及病后虚弱[1]。原方升血调元汤仅对何首乌药材进行了TLC定性鉴别,并采用有毒试剂苯作展开剂,原质量标准水平较低,干扰大,可控性不强,为有效控制升血调元颗粒的内在质量,减少有毒试剂的使用,本实验采用TLC对方中骨碎补、制何首乌、黄芪及佛手进行定性鉴别,并采用高效液相色谱法测定其柚皮苷的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ZF-90型暗箱式紫外透射仪,Agileng1100高效液相色谱仪,G1314A-VWD检测器(美国惠普公司),Sartorius BP221S型万分之一电子天平(德国),MS105DU型十万分之一电子天平(德国),SK250H型超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司),101-A电热鼓风烘箱(上海实验仪器厂),876-1真空干燥箱(南通科学仪器厂)。

1.2 试药

黄芪对照药材(批号:120974-200609,供鉴别用)、黄芪甲苷对照品(批号:110781-200613,供鉴别用)、制何首乌对照药材(批号:120934-200608,121454-200703,供鉴别用)、佛手对照药材(批号:120933-200303,供鉴别用)、骨碎补对照药材(批号:121669-200302,供鉴别用)、柚皮苷对照品(批号:110722-200610,供鉴别及含量测定用),均购自中国食品药品检定研究院;含量测定用甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯。

升血调元颗粒(广东环球制药有限公司,规格:5 g/袋,批号:100901,101001,101002,081001,081002,081003,0201025,0201028,0201030,0201101,0201104,0201106,0201108,0201122,0201125,0201127)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别2.1.1 骨碎补的鉴别[2-4]取本品10 g,研细,加甲醇40 mL,加热回流30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30 mL使溶解,用三氯甲烷洗涤两次,每次20 mL,弃去三氯甲烷液,水液用乙酸乙酯提取两次,每次20 mL,合并乙酸乙酯液,蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。取不含骨碎补药材的样品10 g,同法制成阴性对照溶液。另取骨碎补对照药材1 g,同法制成对照药材溶液,再取柚皮苷对照品,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录Ⅵ B)试验,吸取上述3种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(1∶12∶2.5∶3)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以三氯化铝试液,置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性对照品无干扰。见图1。

1.缺骨碎补阴性样品 2.柚皮苷对照品 3.骨碎补对照药材 4~6.供试品(批号:100901,101001,101002)图1 升血调元颗粒中骨碎补TLC图

2.1.2 制何首乌的鉴别[2,5-7]取本品10 g,研细,加水30 mL,超声处理10 min,移入离心管中离心分离,倾取上清液,置分液漏斗中,用三氯甲烷提取两次,每次20 mL,合并三氯甲烷提取液,回收三氯甲烷,残渣加无水乙醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。取不含何首乌的样品10 g,同法制成阴性对照溶液。另取制何首乌对照药材2 g,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录Ⅵ B)试验,吸取上述两种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9∶1∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%氢氧化钾乙醇溶液。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照品无干扰。见图2。

1~3.供试品(批号:081001,081002,081003) 4.制何首乌对照药材 5.缺何首乌阴性样品图2 升血调元颗粒中制何首乌TLC图

2.1.3 黄芪的鉴别[2,8-11]取本品10 g,研细,加甲醇20 mL,加热回流1 h,滤过,滤液加在中性氧化铝柱(100~200目,5 g,内径为10~15 mm)上,用40 %甲醇100 mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加水30 mL使溶解,用水饱和的正丁醇提取2次,每次20 mL,合并正丁醇液,用水洗涤2次,每次20 mL,弃去水液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇0.5 mL使溶解,作为供试品溶液。取不含黄芪的样品10 g,同法制成阴性对照溶液。另取黄芪对照药材1 g,同法制成黄芪对照药材溶液,再取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成每1 mL含黄芪甲苷1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录Ⅵ B)试验,吸取上述3种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(1∶10∶2.5∶3)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照品无干扰。见图3。

1.缺黄芪阴性样品 2.黄芪甲苷对照品 3.黄芪对照药材 4~6.供试品(批号:100901,101001,101002)图3 升血调元颗粒中黄芪TLC图

2.1.4 佛手的鉴别[2,12-14]取本品10 g,研细,加水30 mL,超声处理10 min,移入离心管中离心分离,倾取上清液,置分液漏斗中,用三氯甲烷提取两次,每次20 mL,合并三氯甲烷提取液,回收三氯甲烷,残渣加无水乙醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。取不含佛手的样品10 g,同法制成阴性对照溶液。另取佛手对照药材0.5 g,加水30 mL,回流30 min,离心取上清液,用三氯甲烷提取两次,每次20 mL,合并三氯甲烷提取液,回收三氯甲烷,残渣加无水乙醇1 mL使溶解,制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录Ⅵ B)试验,吸取上述两种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9∶1∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性对照品无干扰。见图4。

1.缺佛手阴性样品 2.佛手对照药材 3~5.供试品(批号:100901,101001,101002)图4 升血调元颗粒中佛手TLC图

2.2 柚皮苷含量测定[2,15-16]

2.2.1 对照品溶液的制备 取110 ℃干燥至恒重的柚皮苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL含柚皮苷60 μg的溶液,即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量,研细,取0.3 g,精密称定,加入甲醇20 mL,加热回流3 h,放冷,滤过,滤液置25 mL量瓶中,用少量甲醇分数次洗涤容器,洗液滤入同一量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按照处方量制得不含骨碎补的阴性样品,按供试品溶液制备方法,同法制成阴性对照样品溶液。

2.2.4 色谱条件与系统适用性 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水-醋酸(38∶62∶1.55)为流动相;流速:1 mL·min-1;柱温:30 ℃;检测波长:283 nm;进样量:20 μL;理论塔板数按柚皮苷峰计算应不低于2 500。精密吸取供试品溶液及柚皮苷对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪,在上述色谱条件下测定,色谱图见图5~7。

图5 柚皮苷对照品HPLC图

图6 升血调元颗粒样品HPLC图(批号:081001)

图7 缺骨碎补阴性样品HPLC图

2.2.5 标准曲线的制备 精密称取柚皮苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液,分别精密吸取2,4,6,10,20 μL注入液相色谱仪,测定峰面积,以对照品质量浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为Y=0.000 6X-0.001 2,r=0.999 9。结果表明柚皮苷含量在0.12~1.2 μg具有良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密吸取柚皮苷对照品溶液适量,按上述色谱条件连续进样5次,测定柚皮苷峰面积,计算其RSD=0.87%(n=5),表明该测定方法精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取升血调元颗粒供试品溶液(081001),依含量测定方法分别在0,2,4,6,8 h测定其柚皮苷含量。结果5次测定柚皮苷质量分数分别为0.65%,0.66%,0.67%,0.66%,0.65%,RSD=1.26%。结果表明,样品溶液在8 h内稳定。

2.2.8 重复性试验 取升血调元颗粒样品(081001),按2.2.2方法制备供试品溶液,共6份,依含量测定方法测定其柚皮苷含量。结果6份样品中柚皮苷平均质量分数为0.42%,RSD=0.82%。结果表明,该测定方法重复性良好。

2.2.9 回收率试验 取已知柚皮苷含量的升血调元颗粒适量(081001),研细,精密称定,平行5份,分别精密加入柚皮苷对照品溶液(0.257 1 mg·mL-1)2 mL,按2.2.2项下方法制备供试品溶液,精密吸取10 μL注入液相色谱仪,测定峰面积,计算加样回收率,结果见表1。实验结果表明该含量测定方法的加样回收率符合要求。

表1 升血调元颗粒中柚皮苷回收试验

注:柚皮苷对照品加入量均为0.514 1 mg

2.2.10 样品含量测定 取10批升血调元颗粒,分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液。精密吸取不同批号的供试品溶液及柚皮苷对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪,照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定,结果见表2。

表2 10批升血调元颗粒样品中柚皮苷的测定 mg/袋

3 讨论

升血调元颗粒具有益气养血,补肾健脾的功效。临床上主要用于提升外周血白细胞和其他原因引起的白细胞减少症及病后虚弱。建立其质量标准可有效控制药品的质量,是品质均一的一项重要指标。

升血调元颗粒系从经典名方升血调元汤改变剂型而来,笔者对方中8味中药均进行了薄层鉴别研究,但由于党参的鉴别在后续重现性试验中出现没有斑点的情况,方法重现性差;女贞子鉴别实验发现,在供试品色谱中与齐墩果酸对应位置上的斑点不清晰,方法灵敏度不高;以芒柄花素为检出对象进行鸡血藤的鉴别,结果发现阴性样品有明显的干扰,原因是方中黄芪也含有芒柄花素,方法不专属。麦芽在方中起和胃作用,为佐使药,进行质量标准研究意义不大;因此以上药味均未列入制剂质量标准中。

原方升血调元汤中薄层鉴别采用的展开剂含苯,笔者用低毒的甲苯代替苯进行实验,多次实验结果表明,用甲苯取代苯作展开剂得到的薄层色谱斑点清晰,分离度好,与用苯作展开剂差异不大。

升血调元颗粒中,骨碎补为君药,而柚皮苷又是骨碎补中具有代表性的活性成分,因此笔者将其作为指标性成分,对骨碎补进行定量分析,并经反复摸索,确定供试品溶液的制备方法及色谱条件。结果显示,样品的平均回收率为100.47%,RSD=1.6%(n=5)。该方法专属性强、重复性好,可作为升血调元颗粒的质量控制标准。

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StudyonQualityStandardofShengxueTiaoyuanGranule

YUAN Chunping,LIN Bishan,WU Jieying,HUANG Zhangxin*

(Medi-worldPharmaceuticalCo.Ltd,Shunde528303,China)

Objective:Establish the quality standard of Shengxue Tiaoyuan Granule.Methods:The qualitative identification of Drynariae Rhizoma,Polygoni Multiflori Preparata Radix,Astragali Radix and Citri Sarcodactylis Fructus were carried out by TLC,the content of naringin was determined by HPLC.Results:In TLC chromatography,the spots of Drynariae Rhizoma,Polygoni Multiflori Preparata Radix,Astragali Radix and Citri Sarcodactylis Fructus were clear and had good reproducibility.In the content determination experiments,naringin had a good linear relationship in 0.12-1.2 μg (r=0.999 9).The average recovery of naringin is 100.47%,RSD=1.6% (n=5).Conclusion:The method is accurate,feasible and reproducible,can be effectively used for the quality standard of Shengxue Tiaoyuan Granule,and provide a scientific basis for the quality control and standard enhancing of Shengxue Tiaoyuan Granule.

Shengxue Tiaoyuan Granule;Quality standard;TLC;HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.08.013

2014-01-26)

*

黄掌欣,工程师,研究方向:新药开发;E-mail:rghzx@126.com

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