木薯疫霉根腐病病原初步鉴定及其生物学特性测定

卢昕+李超萍+裴月令+郭涵+时涛+黄贵修

摘 要 2010年11月，在对海南省儋州市的木薯病害调查中发现一种根腐病。经致病性评价，分离获得病原菌。显微观察发现，菌丝无分隔，孢囊梗呈简单合轴分枝，孢子囊多顶生，倒梨形，厚垣孢子大量产生，球形、顶生。形态观察结果初步表明，其为棕榈疫霉（Phytophthora palmivora）。ITS序列分析表明，其和几株棕榈疫霉（HQ237481，HQ237478和HQ237477）的序列同源性为99%。生物学特性研究表明，OA或CMA培养基、26～30℃、pH 5、D-木糖醇、乙酸铵、光暗交替是病菌生长最适条件，菌丝致死温度为50℃，10 min。

关键词 木薯 ；疫霉根腐病 ；生物学特性

分类号 S435.33

Preliminary Identification of a Pathogen Causing Phytophthora Root Rot Disease of Cassava and Its Biological Characteristics

LU Xin1） LI Chaoping2） PEI Yueling2） GUO Han2） SHI Tao2） HUANG Guixiu2）

（1 Environment and Plant Protection College， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， P. R. China；

2 Environment and Plant Protection Institute /

Ministry of Agriculture Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops /

Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests，

CATAS， Haikou， Hainan 571101， China）

Abstract A cassava root rot disease was found in Danzhou of Hainan Province during a survey in November 2010. The pathogen was isolated with following Koch's postulates. Microscopic observation results showed the mycelium wasn't separated， the sporangiophore were simple sympodial branches. Most of the sporangium were formed on the top， obpyriform. The chlamydospores were spherical， formed on the top and produced abundantly. The preliminary results showed the pathogen was Phytophthora palmivora， and the ITS sequence had homology of 99% with several sequences （e.g.， GenBank Accession Nos. HQ237481， HQ237478， and HQ237477） of P. palmivora. The optimal condition for the mycelium growth included OA or CMA medium， 26℃ to 30℃， pH 5， D-xylitol， ammonium acetate and alternative light， and the lethal temperature of mycelium was 55℃ for 10 min.

Keywords Cassava ； Phytophthora palmivora ； Biological characteristics

木薯（Manihot esculenta Crantz）属大戟科木薯属植物，原产于南美洲的亚马逊河流域，是三大薯类作物（马铃薯、甘薯、木薯）之一，也是世界六亿以上人口的主要热量来源。木薯广泛栽培于南北纬30°之间，海拔2 000 m以下，年均气温18°以上的热带和部分亚热带地区。木薯也是我国热区重要的经济作物，主要用于生产淀粉和酒精，是我国最大的生物能源产业。据国家木薯产业体系的统计，2013年种植面积47.33万hm2，鲜薯总产量1054.7万t。

国外研究表明，疫霉属[1]、腐霉属[2]和镰刀菌属[3]等多种病原菌均可为害木薯根部，但国内尚无相关报道。2010年11月，笔者在海南省儋州市的木薯田里（品种为华南205）发现一种根腐病。病原菌主要危害块根，严重影响植株的长势而降低产量和品质。开展该病的病原分离、鉴定及生物学特性研究，为进一步开展防控技术等研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫霉根腐病病样和木薯品种

木薯疫霉根腐病病根采自海南省儋州市的发病木薯田。供试木薯品种为‘华南205，由中国热带农业科学院热带作物品种与资源研究所提供。

1.1.2 培养基和试剂

所需培养基和试剂分别参照方中达[4]和时涛等[5]的方法进行制备和购买，引物ITS1和ITS4参照WHITE T J等[6]的序列进行合成。endprint

1.2 方法

1.2.1 木薯疫霉根腐病病菌的分离和致病性测定

田间采集植株发病块根，参照方中达[4]的方法分离和纯化病原菌。

参照J.A. Ekundayo和Theresa M. D[7]的方法进行致病性测定。具体方法如下：用孔径为0.6 cm的打孔器在PDA平板上培养一周的菌落边缘打取菌饼，选取新鲜无病的木薯块根，自来水冲洗干净，在4%次氯酸钠溶液中消毒3 min再用无菌水冲洗3次，晾干。在木薯块根上选取同一横截面的4个位置，用无菌的打孔器打取1个厚度约0.4 cm的薯钉，其中3个放入菌饼，另外1个放入同样大小的无菌PDA培养基块作对照，盖回薯钉，28℃保湿处理。28℃保湿培养7 d后去掉菌饼和培养基块，观察发病情况。从病斑上重新分离病原菌，观察其菌落及孢子囊等性状，并与接种菌株进行比较。

1.2.2 木薯疫霉根腐病病菌的鉴定

参照易润华等[8]的方法进行病原菌基因组DNA的提取。参照郑小波[9]、时涛等[5]的方法进行病原菌落形态、孢子囊等结构的观察和测量，ITS序列分析和生物学特性研究，其中菌丝致死温度设42、44、46、48、50、52、54℃等处理。

2 结果与分析

2.1 木薯疫霉根腐病病菌的分离

笔者在海南省儋州市发现了木薯根腐病。块根受侵染后，出现灰白色、灰黑色或黄褐色，规则或不规则的变色现象。严重时病斑不断扩大，逐渐深入根内部，最终局部或整个根部组织呈海绵状腐烂变褐，并产生刺激性的酸臭味（图1）。从华南205的病薯中分离到1株病原菌，编号为：CPPHN01。

致病性测定结果表明，菌株能够在块根上形成与田间症状类似的变色现象，而对照只是出现轻微的褐变（图2）。从发病部位重新获得了培养性状与接种菌株一致的分离物，表明该菌株为该病的致病菌。田间发病情况类似的症状。

2.2 木薯疫霉根腐病病菌CPPHN01的鉴定

2.2.1 CPPHN01的形态观察

菌株在PDA平板上，形成圆形的菌落，边缘较整齐。菌落白色，边缘浅黄色，气生菌丝较旺盛（图3a）。病原菌的菌丝无分隔。菌落表面的孢囊梗呈简单合轴分枝；孢子囊多顶生，倒梨形，29.3～52.8 μm×22.3～35.1 μm，长宽比1.3～1.5，有较明显的单个乳突。孢子囊具脱落性，孢囊柄短，长1.3～5.0 μm（图3b）。孢子囊成熟后释放球形的游动孢子，排孢孔宽3～8 μm。厚垣孢子大量产生，球形、顶生，大小为27.9～40.1 μm（图3c）。参照陆家云[10]的相关记载，初步鉴定该病病原菌为疫霉属的棕榈疫霉（Phytophthora palmivora）。

2.2.2 CPPHN01的rDNA ITS序列分析

采用PCR扩增获得了CPPHN01的rDNA ITS序列，分析结果表明，其全长为873 nt，已提交NCBI数据库，登录号为HE580279。序列比对结果表明，它和几株棕榈疫霉（HQ237481，HQ237478和HQ237477）的序列同源性为99%。

2.3 CPPHN01生物学特性研究

CPPHN01在供试的8种培养基上均能正常生长，而在OA和CMA培养基上生长速度最快，分别为1.44和1.48 cm/d（图4）。CPPHN01生长的最适条件为26～30℃（1.12～1.15 cm/d，图5）、pH 5（0.94 cm/d，图6）和光暗交替（1.21 cm/d，图7）。最适碳源D-木糖醇（0.88 cm/d，图8），最适氮源乙酸铵（0.95 cm/d，图9），D-木糖、草酸铵则抑制其生长。不同的高温处理结果表明，50℃以上的高温处理后菌丝即失去了生长能力，表明菌丝的致死温度为50℃处理10 min（图10）。

3 讨论与结论

2010年，笔者首次在海南省儋州市发现根腐病。随后的调查结果表明，该病在云南保山、广东湛江等木薯主产区均有发生。地势低洼、排水不良、过度密植等造成田间湿度大的田块发病重，地下害虫为害和台风影响同样会加重病害的严重度。从发病木薯上采集病样，分离病原菌，经显微形态观察和ITS序列分析，初步鉴定其为棕榈疫霉。

病原菌的生物学特性研究结果表明，生长最适条件为OA或CMA培养基，26到30℃，D-木糖醇，乙酸铵，pH5和光暗交替。碳氮源中，D-木糖和草酸铵能够抑制病原菌的生长。菌丝致死温度为50℃，10 min。冯岩等[11]也对侵染番木瓜的棕榈疫霉进行了生物学特性研究，结果表明V8培养基，pH 5.5～7.2，26～28℃，蔗糖和蛋白胨为其生长最适条件，硫酸铵则抑制其生长。郑金龙等[12]发现，侵染剑麻的棕榈疫霉在26～28℃，pH 6.0～7.0，CA培养基上生长最好。这些不同寄主来源的病原菌在生物学特性方面存在着差异，表明菌株之间存在着变异。

棕榈疫霉是一种多寄主的植物病原真菌，能够侵染马拉巴栗[13]、昆士兰瓶树[14]等观赏树木，番荔枝[15]、橡胶树[16]、可可树[17]、胡椒、菠萝[18]等热带经济特色经济作物，也能够侵染泡桐、柑橘、冬青[16]等北方植物。木薯和橡胶树均为大戟科植物，以前仅在橡胶树上有棕榈疫霉的发生报道，本研究所分离的CPPHN01和危害橡胶树的菌株有什么异同点，还需要进行进一步的研究。

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