热带作物顽拗型种子保存研究进展

田新民+李洪立+何云+洪青梅+胡文斌+李琼

摘 要 本文概述顽拗型种子的生理特性和目前主要保存技术，从作物种类和研究内容方面详细阐述了热带作物顽拗型种子保存的研究进展，就存在的问题进行深入分析总结，并对未来的研究重点作出展望。

关键词 热带作物 ；顽拗型种子 ；保存

分类号 S339.3+2

Research Progress on Recalcitrant Seeds Storage of Tropical Crops

TIAN Xinmin LI Hongli HE Yun HONG Qingmei HU Wenbin LI Qiong

（Tropical Crops Genetic Resources Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China）

Abstract The physiological characters of recalcitrant seeds and its current preservation techniques were summarized. The research progress of seed storage for tropical crops， including the crop types and research focus， were elucidated in detail. Finally， existing problems for the storage recalcitrant seeds were discussed and the future research focus is prospected.

Keywords tropical crops ； recalcitrant seeds ； storage

种质资源主要包括种子、种苗和各种离体材料等，其中种子是种质资源最主要的组成部分，携带父母本各一半的遗传信息，并且易储运，不易腐烂，占用空间小，繁殖再生能力强，是遗传育种和作物栽培最直接的原始材料。因此，种子保存是最经济、安全和高效的种质资源保存方式，可以节约大量的人力和物力。近年来，全球植物物种多样性迅速减少，拯救和保存植物物种资源被世界各国所高度重视[1]，发达国家陆续建立了一批现代化的种质保存库，中国也建立了多个专业的种质保存库，如建立在北京的国家农作物种质保存中心和昆明的西南野生生物种质资源库。近年来，国家重点投资建设的种子保存大项目，经过几年的努力，成功抢救和保存了国内大量的珍贵植物种质资源。保存的物种不乏一些重要作物、珍贵濒危和极端环境物种资源，但极少涉及热带作物顽拗型种子资源。热带作物主要包括天然橡胶、木薯、油棕等作物，香蕉、荔枝、芒果等热带水果以及咖啡、桂皮、八角等香（饮）料，是重要的国家战略资源和日常消费品。鉴于热带作物对国民经济发展的重要性，其种质资源的保护尤为重要。中国目前已收集和保存的热带作物种质资源达4万多份[2-3]，包括橡胶树、木薯、热带果树、热带牧草以及热带香辛饮料等作物，主要以种质圃的形式保存，占用土地面积大，且易受病虫害和自然灾害（台风、寒潮等）的破坏，更新和维护成本高，种质的遗传多样性也受到了很大的限制。因此，热带作物种子的长期、安全保存对热带作物种质资源的保护和利用至关重要，与热带作物产业的发展息息相关。本文就热带作物顽拗型种子特性及其主要保存方法和技术、近年来热带作物种子保存的研究进展以及存在的问题进行详细的论述，并就未来的研究重点作出了展望。

1 顽拗型种子特性

种子类型、种子质量、种皮的完整性、种子含水量以及保存环境是影响种子寿命的5大因素，其中种子类型是最重要的因素。根据种子的生理特点，种子可分为正常型种子（orthodox seed）、中间型种子（Intermediate seed）和顽拗型种子（recalcitrate seed）[4-5]。75%～80%的被子植物种子是正常型种子[6-7]，能在-20℃的低温保存很长一段时间；5%～10%的被子植物种子产生顽拗型种子[8]，在热带地区大约47%的物种种子为顽拗型种子[7，9-11]。10%～15%的被子植物种子为中间型种子，有一定的耐脱水能力，在低温条件下可以存活一定时间[12]。顽拗型种子与正常型种子的不同在于，顽拗型种子脱离母株时不经过成熟脱水期，其含水量相对较高（20%～60%），且对脱水及低温高度敏感，采收后不久便可自动进入萌发状态，一旦脱水（即使含水量仍很高）即影响其萌发，导致其生活力的迅速丧失，温度过高或过低也会严重影响其活力，因此不耐贮存，寿命很短，主要包括一些水生植物、热带植物以及小部分温带植物的种子[4]。此外，同属内的物种间其种子储藏特性也有一定的差异（如咖啡属和柑橘属），种子耐干燥的能力因物种而异，和其在分类学上的亲缘关系没有必然的关联[6，13-14]。多数顽拗型种子含水量降至15%～20%时即受到伤害，并且对0℃以上的低温敏感。Farrant等[15]根据忍耐水分亏缺能力的不同，又将顽拗型种子分为低度、中等和高度3类。低度顽拗型种子能忍受一定的水分丧失和较低的温度，一般分布于亚热带和温带地区，如壳斗科栎属的板栗、棕榈科的丝葵等；中度顽拗型种子能忍受中等程度的脱水和稍高的温度，如可可和橡胶树；高度顽拗型种子通常分布于热带雨林湿地，其脱落酸（abscisic acid，ABA）含量低，缺乏类脱水素蛋白，仅能忍受少量的水分丧失，而且对温度高度敏感。由于顽拗型种子对低温脱水的敏感性，给长期贮藏带来了极大困难，大多数顽拗型种子又具有极高的经济价值和保存价值，因此对顽拗型种子保存的研究意义显得尤为重要。热带作物种子除去木薯（正常型种子）和极个别作物外[16-18]，大多属于顽拗型种子，其中热带果树种子全部为顽拗型种子。endprint

关于顽拗型种子不耐脱水贮藏的机理，迄今仍没有一致的令人满意的结论。通常认为，顽拗型种子脱水伤害的3个可能位点是：膜、酶和染色体[19]。一些顽拗型种子在脱水时，溶质渗漏大量增加，表明膜的完整性受到破坏[20-21]。关于顽拗型种子脱水时的超微结构变化已有一些报道。坡垒、青皮种子脱水后，导致内质网上核糖体减少、质体中淀粉消失及细胞空泡化等。Berjak等[22]也发现，Landophia kirkii种子在硅胶上干燥15 d后，其胚轴细胞发生显著变化，种子死亡时原生质解体。

2 顽拗型种子主要保存方法和技术

2.1 短期保存

根据顽拗型种子不耐脱水及低温的生理特性，在不影响种子活力的前提下，应尽可能降低种子贮藏温度及含水量，减少种子贮藏过程中的代谢活动，并添加杀菌剂保存种子，达到短期贮存的目的。如黄皮种子自然条件下的寿命只有10多天，但将生理成熟期的新鲜黄皮种子部分脱水，加入4%～6%的百菌清，在15℃的温度条件下装于塑料袋中贮藏，60 d后仍可保持90%的发芽率[23]；将橡胶树种子先进行部分脱水使种皮趋于风干后，置于能换气的塑料袋中，于15℃下贮存85 d后仍保持90%的发芽率[24]。这种方法只能有限地延长种子的寿命，且贮藏过程中种子活力仍不断下降，达不到长期保存的目的。

2.2 超低温保存

顽拗型种子在适度的水分状态和超低温状态下，不仅能维持种子活力，保持组织和细胞形态的完整性和遗传稳定性，防止物种衰老，还能使种质材料免受病虫的侵害。在超低温条件下，细胞内的物质代谢和生命活动几乎完全停止，最大限度地抑制了其生理代谢强度。从理论上讲，细胞、组织和器官在超低温保存过程中不会发生遗传变异和性状的改变[25]。但是，如果生物机体细胞内的水在降温过程中发生结冰，造成细胞结构的损伤和破坏，最终会导致细胞死亡。因此，超低温保存的关键，是避免降温过程中细胞内结冰。一般来说，随着温度的降低，细胞外溶液先于细胞内含物结冰，造成细胞内外的压力差，只要降温速率不超过脱水速度，细胞内的水就不断向外渗透和扩散，细胞原生质溶液逐渐浓缩，细胞内含物的冰点也在降低，能有效地遏制细胞内溶液结冰。但是，细胞的过度失水可能造成细胞内有害物质的积累（如自由基），使得蛋白质和酶的结构发生改变，从而破坏膜的完整性[25]。在降温冰冻过程中，避免细胞内结冰和过度失水是超低温保存技术中的核心问题。研究表明，控制冰冻速度和添加冰冻保护剂对防止细胞内结冰尤为重要[26-28]。

通常情况下用-196℃的液态氮快速冷冻[1，29-31]，该技术要求组织快速脱水和制冷，小样品要求有一定的扩散和热传递速度，以防止冰晶形成[32-33]。一般认为胚是超低温保存的最佳材料，因为胚是植株的雏形，包含绝大部分的遗传信息，体积小，在短时间内脱水而不影响活力，而且与其他材料相比，胚的耐脱水和耐低温能力更强[34-39]。因此大多数顽拗型种子超低温保存均选用生理成熟期的胚（或胚轴），而且材料越新鲜，效果越理想[15]，也有采用幼胚作外植体的，如可可幼胚[40]。另外，添加冷冻保护剂可防止冷冻和脱水过程中结构的破坏，减少胁迫相关的自由基调节的损害[22，29-30]。

3 热带作物顽拗型种子保存研究进展

3.1 研究范围和内容

目前，在热带作物顽拗型种子保存研究领域，只涉及荔枝、龙眼、橡胶树、油棕、黄皮、芒果、咖啡、胡椒、可可、澳洲坚果、火龙果等作物，研究报道比较多的有荔枝、龙眼、芒果、橡胶树和澳洲坚果等种植面积较大的作物，其研究内容主要集中于种子在不同采收时间、脱皮方法、成熟度等条件下的萌发特性，不同温度和含水量下的种子储藏特性。另外，对可可、椰子、咖啡等作物胚轴还进行了超低温保存的探索。但是，到目前为止，部分热带作物（如腰果、莲雾、杨桃等）种子属性依旧不清楚，其萌发特性和保存条件方面还没有相关研究报道。

3.2 研究动态及进展

3.2.1 荔枝、龙眼

研究结果表明，荔枝和龙眼种子的生长发育早于其果实，当种子成熟时，果实仍未完全成熟，此时种子鲜重已达高峰，发芽率为100%，当果实成熟采收时，种子对部分脱水的忍耐力反而下降，表明种子成熟后在果实中又进入了萌发状态，因而不耐脱水。荔枝和龙眼种子发育早期含水量一直下降，但此时水分总量却不断上升，当种子即将成熟时，水分总量维持在较为恒定的水平，在40%以上（荔枝44.6%，龙眼42.5%）[41]。在自然脱水过程中，荔枝和龙眼种子的发芽率随含水量下降而降低，至8 d后二者完全丧失发芽能力，其含水量大概维持在18%[42]。只要种子含水量高于25%，发芽率就不会受到严重影响；但含水量低于25%时，发芽率急剧下降。当含水量降至20%或更低时，如不及时调节干燥环境，种子将不能再萌发。因而，种子萌发率与临界含水量之间存在着显著的正相关。当种子含水量低于20%时，种皮逐渐“硬化”，对水几乎没有透性。Sowa等[43]通过将麻醉剂（N2O）和氧气（O2）混合使用来延长荔枝和龙眼种子的寿命，荔枝种子在80%N2O和20%O2条件下存储，12周以后仍能保持92%的萌芽率；龙眼种子放在80%N2O和20%O2的混合气体中，7周以后可保持70%的萌芽率。原因可能是N2O对湿润环境下的种子呼吸代谢有抑制作用，可以减慢种子的萌发，同时也能抑制好氧微生物的代谢和生长。麻醉剂N2O和02的混合使用，为人类提供一种贮存顽拗型种子的最新方法和新思路。夏清华等[44]尝试通过超低温方法进行荔枝和龙眼胚轴的保存，荔枝和龙眼种子离体胚轴的临界含水量分别为30%和23%，低于此值时，其生活力迅速下降，高于临界含水量的龙眼种子离体胚轴，经液氮贮存后无一存活。与种子相比，胚轴对脱水的忍耐力更大，而且龙眼胚轴比荔枝胚轴对部分脱水的忍耐力更大[41]。

3.2.2 橡胶树endprint

橡胶树种子是典型的顽拗型种子，在成熟落地后随即萌发，且萌发率极高，达到62.7%，对脱水具有高度的敏感性[45-46]，在快速和缓慢脱水条件下的种子致死含水量分别为40.3%和48.9%[47]。研究表明，橡胶树种皮对种子吸水和萌发具有明显的机械限制作用，且萌发速率系数随着温度的升高先增大后减小[48]。韦焕琦等[49]通过连续测定不同贮藏条件下种子的电导率、含水量和发芽率，研究橡胶树种子的膜透性对其发芽率的影响，结果表明，在22℃、湿度为95%、包膜度为75%时，橡胶树种子的电导率增幅最小，内含物消耗速率与种子呼吸速率适宜。种子在贮藏过程中电导率不断升高，表明膜系统受到破坏，导致种子内电解质外渗，伴随着橡胶树种子含水量和发芽率的降低。王军等[50]利用正交试验在人工气候箱内对橡胶树种子短期贮藏过程中的温度、湿度、包膜度最佳组合进行研究，通过对不同处理条件下种子的发芽率、超氧化物岐化酶（SOD）活性、电导率、碱性磷酸酶等指标的测定分析和比较，建议在生产实践中，橡胶树种子短期贮藏最佳的温度、湿度和包膜度应分别为19～22℃、95%、65%～75%。另外，橡胶树种子胚轴脱水至临界含水量后，经液氮贮存有70%的存活率，但是存活的胚轴不能产生完整的幼苗[51]。

3.2.3 芒果

关于芒果种子保存方面的研究报道也较多，主要涉及种子脱水与贮藏的关系、保存温度和储藏的关系以及储藏条件的优化等方面[52-56]，关于超低温保存方面的研究还是一片空白，种子对脱水和低温敏感性机理的研究尚未涉及。王晓峰等[57]发现用ABA处理芒果种子能降低芒果种子（特别是成熟度较低者）的脱水敏感性，说明抑制或延缓种子萌发可降低种子对脱水的敏感性，而且芒果种子对脱水的敏感性与其在母株上开始的与萌动相关的一些生理生化变化有关。另外，除贮藏条件外，种子发育过程中的生理生化变化与种子的寿命也有很大关系[58]。

3.2.4 澳洲坚果

罗萍[59]进行了澳洲坚果种子的萌发实验，结果表明，澳洲坚果种子鲜播17～20 d后开始萌发，25～35 d进入萌发高峰期，85 d后种子不再萌发，不同收获期和不同品种的种子发芽率也有差异。化学药剂对接近成熟的澳洲坚果种子萌发有一定影响。贺熙勇等[60]用赤霉素对不同品种澳洲坚果种子进行了处理，结果表明，赤霉素（100～500 mg/L）处理能极显著提高种子萌发率。对种子使用不同脱皮方式后，其萌发率也有一定差异，人工脱皮种子萌发率极显著高于机械脱皮种子[61]。研究表明，不同时期落果的澳洲坚果种子活力与果实的成熟度有密切关系，随着果实发育成熟，内果皮颜色由淡黄色渐变为褐色，于7月下旬达到生理成熟期，此时种子活力最高，种子出芽率达到84%[62]。

3.2.5 其它

杨华庚[63]研究了胡椒和中粒种咖啡种子在常温自然贮藏条件下的萌发特性，结果表明，自然贮藏20 d，干燥脱水对胡椒种子的伤害较轻微，其种子发芽率和活力指数仍高达82.7%和1.03；之后由于严重脱水，种子发芽率和活力指数迅速下降；自然贮藏60 d，其种子含水量下降至10.91%时，完全丧失发芽力。自然贮藏30 d，干燥脱水对中粒种咖啡种子的伤害较轻微，种子发芽率仍高达80.5%；之后由于严重脱水，种子发芽率和活力指数急剧下降；自然贮藏90 d，种子含水量下降至9.81%，种子几乎完全丧失发芽力。

将木菠萝种子先进行部分脱水（含水量约51%），然后放入扎有针孔的袋中，再装入含水量为50%的珍珠岩袋中，分别在5、10、15℃中贮藏，结果表明，贮于5、10℃中的种子先后发生低温伤害；15℃的贮藏效果最佳，种子寿命延长至815 d[64]。2种类型木菠萝种子在不同贮藏期的发芽率表明，在相同贮藏期条件下，湿苞木菠萝种子的发芽率较干苞木菠萝种子高；在不同贮藏期条件下，2种类型木菠萝种子随采随播的发芽率分别达97%和88%；贮藏时间越久，种子的发芽率越低，贮藏4周后，湿苞和干苞种子发芽率分别只有32.1%和28.3%[65]。

此外，赵春香等[66]对火龙果种子的萌发特性进行了探索，结果表明，火龙果种子适宜浸种时间为4～6 h，最适合发芽的温度为25℃，某些植物生长调节剂如NAA（萘乙酸），IAA（吲哚乙酸）等对火龙果种子萌发有较好的促进作用。

4 热带作物顽拗型种子超低温保存现状

利用超低温保存技术在热带作物顽拗型种子保存方面进行的一些探索，除对橡胶树胚进行液氮超低温保存外，研究人员还对可可[40]、椰子[67]、油棕[68-70]、咖啡[28]和黄皮[23]等几种顽拗型热带作物种子的超低温保存进行了研究，通过利用液氮对上述几种作物的胚轴进行冷冻保存后，发现仅可可幼胚、椰子胚的胚轴经超低温贮存后产生了幼苗，其余的顽拗型作物种子只保持生根、茎或产生愈伤组织的能力，在培养时间内均未能产生完整的幼苗。可以认为，目前对热带作物顽拗型种子超低温保存的研究结果只是初步的，经超低温保存后的恢复生长效果并不理想，距离实际应用还有一定差距。

5 热带作物顽拗型种子保存研究存在的问题及展望

随着人类对物种资源保护意识的不断加强，目前对顽拗型种子保存的研究已经成为国际种子学术会议的热门课题，但由于顽拗型种子本身的特性和保存难度，目前的研究工作还处于初级阶段，研究内容的深度与广度都不够，世界上只有少数课题组在进行保存技术和理论方面的研究，且较多的研究工作偏重于贮藏条件与种子发芽率的关系上，对顽拗型种子的不耐脱水机理和低温敏感性机理缺乏深入的研究。应用种胚进行超低温贮藏已有可喜的开端，但只限于少数顽拗型种子物种，且其在液氮中保存的时间很短，保存后的存活率也不高，大多数胚（或胚轴）经超低温保存后仅产生愈伤组织、根、茎或不定芽，关于能正常成苗的顽拗型种子的遗传特性及生长情况也没有追踪报道，能否用于生产尚有待试验。顽拗型种子的超低温保存仍然面临很多问题，如顽拗型种子往往比中间型和正常型种子大，大多数顽拗型种子由于太大而不能在液氮中有效地快速脱水和制冷，部分作物种子的胚轴代谢活跃，或由于胚轴太大而限制了能量的扩散和交换速度，这些因素都大大限制了超低温保存技术在顽拗型种子保存中的探索和应用。endprint

有关热带作物顽拗型种子的研究集中于20世纪80～90年代，近10年来的研究报道相对较少，而且上述研究大多只涉及种子萌发及影响萌发的外部和内部因素等，保存方法大多只涉及短期保存，仅仅对少数几种作物进行了超低温保存的探索。核心的问题即保存技术还没有取得实质性的突破和进展，没有形成完全成熟的保存技术。因此，未来的研究须从低温和脱水敏感性机理入手，解决理论上的障碍，从理论上取得重大突破，在此基础上，运用现代科学技术，重点在保存技术上取得更大的突破和进展，完全掌握顽拗型种子保存的核心技术，能够长期、安全和高效地保存顽拗型种子，从而为热带作物种质资源以及世界植物多样性的保护提供强有力的支撑。另外，加强顽拗型种子保存研究，还应扩大供试种类，从不同植物类群入手，总结出更多有规律的经验和方法，提高保存后的种子存活率和幼苗的生活力，并跟踪研究能成苗的植物生长及遗传特性，为实际应用提供理论依据。

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