水稻转绿型叶色突变体研究进展

贺治洲+尹明+谢振宇+沈建凯+王悦

摘 要 水稻叶色突变体是开展光合作用机理研究的理想材料，还可以作为标记性状在杂交水稻种子生产中发挥重要作用。转绿型叶色突变体是一种叶色突变后在一定条件下可恢复绿色的叶色突变类型，目前在水稻中已定位了至少36个转绿型叶色突变基因，其中有8个基因已被成功克隆。本文综述转绿型叶色突变体的主要类型和特征特性、基因定位与克隆、分子机理及其作为标记性状在育种上的应用情况，以期为水稻转绿型叶色突变体的研究与应用提供参考。

关键词 水稻 ；叶色突变 ；转绿 ；分子机理 ；育种应用

分类号 S511

Research Advances on Green Revertible Leaf-color Mutants in Rice

HE Zhizhou1） YIN Ming1） XIE Zhenyu1） SHEN Jiankai1） WANG Yue2）

（1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China

2 College of Agronomy， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan， 410128， China）

Abstract Rice leaf color mutants are ideal materials for studying the mechanism of photosynthesis； it also can be used as the marker trait plays an important role in hybrid rice seed production and purity identification. Green revertible leaf-color mutant is a kind of mutant that leaves could turn green under certain conditions. At present， at least 36 green revertible leaf-color mutant genes have been mapped to chromosomes； including 8 genes of them have been cloned successfully. Here， we review the types and characteristics， gene mapping and cloning， molecular mechanism of green revertible leaf-color mutants， and its breeding application as a marker trait， in order to provide reference for the future research and application of green revertible leaf-color mutants in rice.

Keywords rice ； leaf-color mutant ； green revertible ； molecular mechanism； breeding application

水稻是最重要的粮食作物之一，其产量的90%～95%来自叶片叶绿体的光合作用，提高光能利用率是提高水稻产量潜力的重要途径之一[1-2]。叶色从表型上直接反映了光合作用过程中光合色素含量与组成的变化情况，利用叶色突变体是开展光合作用研究的理想材料，它在植物的光合色素合成、叶绿体结构、功能、分化与发育等基础研究中具有重要作用。在水稻育种与生产实践中，由于叶色突变具有明显易于识别的优势，作为一种标记性状，在杂交水稻繁殖制种和F1种子纯度鉴定中的利用价值受到广泛关注。叶色突变是自然界中比较常见、突变频率高的突变形式，类型非常丰富。1942年Gustaffsson[3]将叶色突变体分为白化、黄化、浅绿、条纹、斑点5大主要类型。随着叶色突变体发现类型的增多，1980年Awan[4]等进一步将叶色突变体细分为白化、黄化、浅绿、条纹、绿白、白翠、黄绿、绿黄8种类型。这两种分类方法都是依据苗期叶色进行的静态分类法，然而很多叶色突变体随着生长发育或者在光温等环境因素调控可出现叶色动态变化的过程，其中最为常见的是叶色变异后在一定条件下可恢复绿色的转绿型叶色突变。此类叶色突变体特有的叶色变化特征，对于深入研究水稻叶色变异的分子机制和应用于标记性状水稻新品种选育方面都具有很好的利用价值。本文综述水稻转绿型叶色突变体的主要类型和特征特性、基因定位与克隆、分子机理及其作为标记性状在育种上的应用情况，以期为水稻转绿型叶色突变体的基础研究与实践应用提供参考。

1 水稻转绿型叶色突变体的主要类型和特征特性

1.1 水稻转绿型叶色突变体的主要类型

从叶色转绿表型来看，目前发现并有报道的主要有白化转绿、黄化转绿、条纹转绿等类型；从转绿过程的调控类型来看，有生育进程调控型，温度调控型，也有的转绿型突变体同时受到生育进程和温度共同调控。受生育进程调控的大部分转绿突变体只在生长发育的某一时期表现突变叶色，主要在苗期（或者生育前期），随后逐渐转绿，如郭士伟等[5]在水稻品种宜香 B 中发现的白化转绿自然突变体gra，其在4 叶期前叶片呈黄绿色白化，随后逐渐变绿，后期叶色与野生型相似。幼苗白化突变体ysa在3叶期以前叶片白化，之后叶片逐渐变绿，到6叶期完全恢复成绿色[6]。水稻黄绿叶突变体ygl1前期叶片为黄色，中期慢慢转绿，后期叶色接近野生型[7]。也有的转绿突变体前期表现正常、随后出现阶段性的突变叶色，后期又转绿，如白化转绿突变体gra75，该突变体叶片1～3叶表现绿色，从第4叶开始表现白化，到第8叶开始转为正常绿色[8]。张向前等[9]也报道了一个类似的叶色突变体sgra，该突变体幼苗期叶色正常，而6～8叶期以后新生叶白化，随后白化叶转绿。李育红等[10]则发现一个由移栽等机械损伤引起的转绿突变体白淮稻7号，其叶色表型为苗期绿色，移栽后7 d左右突变体叶片呈现白化，移栽后15 d左右，叶片表现正常绿色。Dong等[11]和贺治洲等[12]近期报道的黄化转绿型叶色突变体则表现为每一个新生叶片表现黄化，随后由叶尖向叶基部逐渐转绿，所有叶片都表现为这样一种黄化转绿的动态发育过程。endprint

1.2 水稻转绿型叶色突变体对温度的反应特性

多数转绿型叶色突变体的转绿现象与温度密切相关，水稻叶色突变体v1[13]和v2[14-15]突变体在20℃条件下出现白化叶片，而在30℃条件下叶片转绿。突变体 W1 在温度低于20℃时，叶片均表现白化，在 23℃下呈淡黄色，随着温度的升高叶色由淡黄到淡绿，30℃条件下完全转为正常绿色[16]。W17、W25突变体在25 ℃以下，幼叶完全白化，而在30℃以上时转为浅绿色和正常绿色[17-18]。tsc-1在 23.1、26.1和 30.1℃的梯度下，叶片分别呈现白色、浅绿、绿色的变化过程[19]。白色条斑叶突变体tws，在28℃条件下，苗期5叶期之前表现为白色条斑叶色，到第5 叶开始转为正常。而在28℃以上，叶色均表现绿色[20]。黄化转绿突变体mr21，其在较低温度（<25.0℃）条件下，幼苗叶色呈黄色，随着温度逐渐升高，叶色由黄转绿，其临界温度约为27.5℃[21]。还有一种变温条件下转绿的突变类型如v3和st1突变体在恒定20或30℃的条件下出现白叶表型，而30和20℃交替的条件下则转为全绿[22]。

1.3 转绿型叶色突变体的光合特性

叶色变异往往导致光合色素各成分的含量及比例以及叶绿体的超微结构发生变化，在转绿突变体中，光合色素含量变化规律及叶绿体结构通常与叶色表型变化一致。突变体tsl11在20℃下的叶绿素a、b及类胡萝卜素含量与野生型相比下降80%以上，电镜观察发现其叶绿体发育严重不良，看不到完整的类囊体结构，而在32℃下，突变体的叶绿a、叶绿素b和类胡萝卜素含量及叶绿体数量、 大小，类囊体片层结构与野生型无明显区别[23]。白化转绿突变体gra75苗期白化叶的光合色素含量显著下降，叶肉细胞发育不完善，叶绿体数目减少、形态发育不饱满，类囊体片层、基粒极显著减少，转绿后，叶绿素和类胡萝卜素的含量与野生型差异均不显著，说明转绿叶片的色素合成也随之恢复正常[8]。白化转绿突变体hfa-1，二叶期突变体的叶绿素含量和净光合速率明显低于野生型，而叶绿素a/叶绿素b比值显著高于野生型，苗期突变体净光合速率比野生型减少35.3%，突变体转绿后，二者的叶绿素含量和净光合速率无显著差异[24]。

2 水稻转绿型叶色突变基因的定位与克隆

水稻叶色突变体大都由一对隐性核基因控制，遗传行为简单，表型容易识别。近年来，随着分子生物学的快速发展和分子标记技术的广泛应用，迄今为止有超过130个水稻叶色突变基因被定位[25]，其中包括有36个转绿型叶色突变基因（表1），遍及水稻基因组12 条染色体，白化转绿基因最多，有31个，黄化转绿基因有5个，转绿过程受温度调控的有15个，转绿过程受生育进程调控的有12个，转绿过程受温度和生育进程共同调控的有9个；从转绿型叶色突变基因在染色体上的分布情况来看，第3号染色体和第11号染色体上最多，分别有8个基因。目前已被克隆的36个水稻叶色突变基因中有8个转绿型叶色突变基因，主要是与叶绿素生物合成降解和叶绿体发育相关的基因，包括6个白化转绿基因：V1[13]、V2[15]、V3和St1[22]、YSA[6]、hw-1（t）[26]以及2个黄化转绿基因YGL1[27]、VYL[11]。这些已被克隆的基因及其功能研究，对于阐明水稻叶色变异的分子机制、光合色素的生物合成与降解，叶绿体的发育过程具有重要意义。

3 水稻转绿型叶色突变的分子机理

3.1 光合色素的生物合成与降解途径

植物叶绿素生物合成是一个非常复杂的酶促生化反应过程，由20多个基因编码的15种酶完成，由于大多数叶色突变体直接或间接影响叶绿素的合成或降解，导致叶绿素含量和组分发生变化，从而引起叶色变异。水稻 W1叶色突变体低温条件下，由于叶绿素合成卟啉原形成部位受阻从而导致白化，当温度高于23℃时叶绿素合成正常，叶色逐渐转绿[16]。黄化转绿型叶色突变体ygl1中苗期叶绿素合酶的活性下降明显，叶绿素合成途径中的ALA和四吡咯化合物中间体积累均有明显增加，导致叶绿素合成量明显下降。YGL1基因编码叶绿素合成酶，催化叶绿素合成过程中最后一步叶绿素a 的形成，核苷酸序列分析发现，ygl1与野生型在叶绿素合成酶基因的编码区上有单个碱基差异，由胸腺嘧啶（T）突变为胞嘧啶（C），造成所编码的脯氨酸到丝氨酸的改变，导致叶绿素合成酶的活性下降，延迟了叶绿素的合成[27]。类胡萝卜素是植物三大色素之一，主要分为胡萝卜素和叶黄素，类胡萝卜素既可以吸收光能用于光合作用，又可以保护叶绿素不受光氧化损害。白化转绿叶色突变基因hw-1（t）编码含线粒体交替氧化酶 AOX 结构的叶绿体蛋白，通过参与叶绿体呼吸电子传递链，调控类胡萝卜素生物合成途经及其次生代谢途径；hw-1（t）基因的突变抑制了苗期类胡萝卜素合成，类胡萝卜素、植物激素生物合成相关基因在白化期叶片中表达量减低[49]。

3.2 叶绿体的形成与发育途径

叶绿体是存在于绿色植物叶肉细胞中进行光合作用的一种细胞器，叶绿体的正常发育需要编码叶绿体蛋白的细胞核基因与编码自身蛋白的叶绿体基因间的相互协调，任何一方基因的突变都可能影响到叶绿体的正常发育，从而产生叶色变异。白化转绿突变体v1是受温度调控的突变体，苗期叶片因叶绿体合成受到抑制而表现白化，V1编码一个定位在叶绿体上的蛋白质NUS1，NUS1参与了叶绿体RNA 的代谢调控过程并促进早期叶绿体发育低温胁迫下质体遗传系统的建立，在NUS1 缺失的突变体叶片中，叶片发育早期的叶绿体rRNA积累减少，且低温下叶绿体的翻译和转录能力受到严重抑制[13]。水稻v3和st1突变体的白化转绿表型呈现生长时期和温度特异性，V3和St1分别编码核糖核酸还原酶RNR的大亚基RNRL1和小亚基RNRS1，RNR调节DNA合成和修复过程中脱氧核糖核苷酸的形成速率，RNRL1和RNRS1是叶绿素合成过程中叶绿体DNA复制所必需。v3和st1突变导致核糖核酸还原酶活性降低后抑制了叶片发育早期叶绿体的合成，参与叶绿体转录和翻译以及光合作用的基因其表达都发生了改变，从而出现白化表型[22]。幼苗白化突变体ysa转绿过程受生育进程调控，YSA编码一个含有16个串联PPR基序的三角状五肽重复蛋白，PPR蛋白对调控植物细胞器基因的表达发挥着重要作用，YSA在水稻幼叶和茎秆中高表达，并且其表达受光调节，ysa叶色的改变是和叶绿素含量以及叶绿体发育的变化相关联[6]。全生育期表现黄化转绿的叶色突变体vyl，其新生叶片为萎黄表型，之后自顶端向下逐渐转绿，并伴随叶绿素含量和叶绿体超微结构的变化，以及叶绿体发育和光合相关基因表达的改变，VYL基因编码一个与拟南芥ClpP6亚基同源的蛋白，是叶绿体Clp蛋白酶的亚基之一，在水稻叶绿体生物合成中起重要作用，vyl突变引起预测基因产物早期终止、保守催化三分子（丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸）和多肽结合位点的丢失，VYL基因的表达量与光介导的叶绿体发育进程相关[11]。endprint

3.3 质-核信号传导途径

叶绿体和细胞核基因组之间的协调表达关系到叶绿素和叶绿体正常的生物合成，通过二者之间存在的质-核信号传导途径，质体的代谢状态能影响编码质体蛋白类核基因的表达，核基因产物也可以调控质体基因的转录和翻译，叶色变异的产生与质-核信号传导途径受阻密切相关。v2突变体是温度依赖型的突变体，在一定的温度范围内叶片中不含有叶绿体而表现白化，V2编码一个定位在质体和线粒体上的新型鸟苷酸激酶（GK），GK是鸟嘌呤代谢通路中的关键酶，V2基因在叶片发育和叶绿体发育早期行使功能，参与调节叶绿体发育时期的信号向细胞核传输，V2突变后丧失质体基因的时期特异表达性，核基因组编码的质体蛋白表达被抑制，同时丧失质体蛋白翻译机制功能，影响到叶绿体分化，最终使叶绿体发育不能正常进行，导致叶片白化[14-15]。

4 水稻转绿型叶色突变体作为标记性状在育种上的应用

叶色突变体由于表型明显易于识别，是一种理想的形态学标记。在杂交水稻育种和生产实践中，利用隐性核基因控制的叶色突变材料，可通过育种手段将叶色标记基因导入水稻三系或两系不育系。在不育系亲本繁殖时，识别并去除田间非标记叶色苗，可确保原种纯度；杂交制种时，识别并去除母本中非标记叶色苗，可有效提高杂交种子纯度；对杂交种子进行纯度鉴定时，可将收获的杂交种子在当地秧田或实验室播种，因育性波动导致不育系自交结实的假种子将表现为标记性状叶色，从而可以快速、准确的鉴定出种子纯度，避免种子质量问题对大田生产造成损失。目前在水稻育种上得以利用的叶色标记不育系主要有标记性状在某一阶段表达和全生育期表达2种类型[12，50-52]。转绿型叶色标记材料大部分都是属于某一阶段表达型，一般在苗期表达，后期转绿；由于转绿型叶色标记材料对不育系的主要农艺性状和产量无显著负效应，因此作为标记性状用于解决杂交种子纯度问题上更具优势，从而更为育种者所重视和利用。

近年来，育种家已经选育出多个三系和两系转绿型叶色标记不育系。舒庆尧等[53]、沈圣泉等[54]和李小林等[55-56]利用300Gy60Co-γ射线辐照保持系龙特甫B、Ⅱ-32B和冈46B干种子、诱发产生叶色突变株，以获得的突变株为亲本分别与龙特甫A、Ⅱ-32A和冈46A杂交并连续回交育成带白化转绿型标记三系不育系全龙A和白丰 A，云丰66A和云丰88A，这些三系不育系均表现为苗期第 1～3 叶白化，从第4 叶开始逐渐转绿，后期植株完全转为绿色。赵海军等[42]和卢华金等[57]采用300Gy60Co-γ射线辐照培矮64S，吴伟等[58]利用5Gy60Co-γ射线离体诱变广占 63S干种子，诱变后代选择叶色突变株结合多代系统选育，分别育成携带白化转绿型叶色标记的两系不育系玉兔S、楠丰8S和NHR111S。玉兔S和NHR111S的第1～3 幼叶白化，第4叶开始转绿，第6 叶恢复至正常绿色；楠丰8S幼苗期第1～4叶边缘带白化转绿叶色标记，第5叶后转为正常。这些不育系转绿前由于叶片白化，生长势弱小，但转绿后的主要农艺性状、育性特征和配合力与原不育系相似，携带的白化转绿型叶色标记应用于杂交稻生产可实现高效排假，在提高不育系繁制种纯度，苗期快速鉴别杂交种子纯度方面具有很好的效果。

上述选育成的转绿型叶色标记不育系具有的共同特点是幼苗期白化，4叶期左右开始转绿，随后整个植株逐渐恢复至正常绿色，由于其标记叶色只在苗期表达，对于繁殖制种田块中的落粒谷等后期出现的杂株无标记效用，因此具有一定的应用局限性。贺治洲等[12]利用籼稻保持系材料选育后代中获得一个转绿型新叶黄化自然突变体为标记基因来源，首次育成一个全生育期表达转绿特性的叶色标记三系不育系热农1A，与上述转绿型叶色标记不育系不同，更具特色和利用价值，该不育系全生育期每一片叶都经历幼叶黄化，随后从叶尖向叶基部由黄转绿的动态发育过程，前期叶片完全转绿后，后期的新生叶片依然表现由黄转绿的叶色变化，有趣的是绿叶和黄叶可在同一植株上同时出现，有利于前后期都有效发挥其标记作用；此外由于热农1A单个叶片都只在其发育前期（未展开叶和幼叶）表现黄化，随后转绿，对整个植株的光合作用影响小，植株能够完全正常生长发育，因此是一种新的理想型水稻叶色标记不育系。

5 问题与展望

水稻叶色突变体由于相关基因的突变使光合色素代谢系统中某种酶活性改变或叶绿体发育受阻，以及相关基因的转录或翻译水平降低，导致光合色素形成受阻或降解缓慢，从而产生丰富多样的叶色变异。近年来，随着水稻功能基因组学的快速发展，多个叶色突变基因被克隆和功能鉴定，并已从叶绿素代谢和叶绿体发育以及核-质信号传导等途径初步阐述了相关的分子机理，但对于转绿型叶色突变基因目前还只有少数几个被克隆，其特有的叶色变化过程和调控机制还远未阐明。在杂交水稻的生产与应用中普遍存在不育系育性受环境影响表达不稳定的问题，严重影响种子生产的安全性，给制种和大田生产带来重大损失[50，56，59]。利用叶色标记可有效提高种子生产过程中的除杂效率，快速准确鉴定杂交种子的纯度，但由于叶色突变基因直接或间接影响叶绿素的代谢和叶绿体的发育，导致光合效率下降，影响农艺性状和产量性状，严重时甚至导致植株死亡[60-61]，大部分叶色突变体难以在育种上直接利用。转绿型叶色突变性状具有阶段性特异表达、叶色转绿后对主要农艺性状影响小等优点，因此作为标记性状应用于杂交育种和种子生产等方面尤具优势。进一步发掘和鉴定新的转绿型叶色突变基因，加强实用转绿型叶色标记不育系的选育，有助于深入揭示水稻叶色变异的分子机理和促进转绿型叶色突变体更加有效的应用于生产实践。

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