氨基胍高选择性抑制iNOS在糖尿病大鼠视网膜中的研究＊

罗大卫，邹海东，刘 堃，郑 志，孙晓东，许 迅，朱弼珺

（上海交通大学附属第一人民医院眼科 200080）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常见、最严重的并发症之一，也是成年人低视力和盲的主要原因［1］。DR发病机制迄今尚未完全阐明，且无有效的治愈方法，早期发现、早期治疗对延缓其进展至关重要［2］。一氧化氮（NO）作为一种重要的血管活性物质，与DR中毛细血管闭塞、微循环障碍、内皮细胞增殖相关［3］。一氧化氮合成酶（NOS）是NO合成过程中的关键酶，可直观反映NO在DR中的作用机制［4］。氨基胍是一类NOS抑制剂，可以抑制NOS的活性，对DR等具有一定的治疗效果［5］，但是其作用途径及机制尚不明确，因此，研究氨基胍治疗DR的机制可以指导临床用药，对开发新的治疗药物具有一定的指导作用。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物：健康雄性 Wistar大鼠共60只，体质量180～200g，由安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：SYXK（皖）2012004。在普通环境下（通风，温度18～23℃，湿度50%～60%）饲养，自由饮水。（2）实验试剂与仪器：氨基胍（AG，Sigma）；胰激肽原酶（常州千红生化制药）；链脲佐菌素（STZ，Alexi）；DMEM，诱导型 NOS（iNOS）、内皮细胞型NOS（eNOS）、神经型 NOS（nNOS）ELISA试剂盒购自碧云天；蛋白质提取试剂盒（碧云天），iNOS、eNOS、nNOS抗体，羊抗鼠二抗，鼠β－actin抗体购自北京中杉金桥，手术器材，CO2培养箱，光学显微镜，酶标仪，紫外分光光度计，离心机。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 将60只大鼠分为糖尿病组、氨基胍治疗组和对照组，每组20只。氨基胍治疗组和糖尿病组大鼠使用STZ制造糖尿病模型。按50mg／kg称取STZ溶于pH为4.4的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液，对禁食12h的大鼠进行腹腔注射STZ造模，注射后24～48h取尾血测血糖。造模成功标准：血糖大于16.65mmol／L，对照组20只仅腹腔注射等体积的柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液。

1.2.2 给药方法 氨基胍治疗组大鼠每天灌胃给药氨基胍100mg／kg，糖尿病组和对照组大鼠予等量的生理盐水灌胃。连续灌胃给药14d后，处死大鼠取出双眼眼球，用生理盐水清洗，一只放于4%多聚甲醛中固定过夜后存放于70%乙醇中，用于HE染色；另一只存放于－80℃冰箱中，用于 Western blot和PT－PCR检测。血液在室温下静置0.5h后放于4℃冰箱中过夜，第2天离心后取出上清液存放于4℃冰箱中，用ELISA检测。

1.2.3 HE染色 多聚甲醛固定过的眼球标本用石蜡包埋，连续切片，厚度5μm，常规HE法染色。

1.2.4 ELISA检测大鼠血清iNOS、eNOS、nNOS水平 大鼠血液静置过夜后离心，取上清液，使用iNOS、eNOS、nNOS酶联免疫试剂盒检测血清中iNOS、eNOS、nNOS水平。

1.2.5 Western blot检测大鼠视网膜中iNOS、eNOS、nNOS表达水平 将大鼠眼球组织块取出，剪碎后用蛋白质提取试剂盒提取蛋白，18 000r／min离心1h，去上清液，固定后进行蛋白质定量，然后使用SDS－PAGE电泳分离，转移到纤维膜，封闭。在漂洗后敷iNOS、eNOS、nNOS抗体（1∶500）和β－actin抗体（1∶300），TPBS漂洗后敷二抗（1∶5 000），ECL显色，曝光。

1.2.6 PT－PCR测定iNOS、eNOS、nNOS mRNA表达 将眼球匀浆后，用Trizol法提取总RNA，然后取2μg RNA用逆转录试剂盒合成cDNA，PCR扩增，扩增条件为50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，40个循环。95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。结果采用SDS软件进行2－ΔΔCT法相对定量分析。引物序列：eNOS上游引物5′－GGA GAG ATC CAC CTC ACT GTA GC－3′，下 游 引 物 5′－CAC ATA GGT CTT AGG G－3′，扩增产物长度421bp；nNOS上游引物5′－GTG GAG GTG CTG GAG GAG TTC－3′，下游引物5′－CGG ATT CAT TCC TTT GTG TTG－3′，扩增产物长度374bp；iNOS上游引物 5′－CAA TAA CCT GAA GCC CGA AGA C－3′，下游引物5′－GTA ATC CTC AAC CTG CTC CTC AC－3′，扩增产物长度 496bp；β－actin上游引物5′－CCG TAA AGA CCT CTA TGC CAA C－3′，下游引物5′－ACT CAT CGT ACT CCT GCT TGC T－3′，扩增产物长度227bp。

1.3 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计量资料采用x±s表示，多样本均数比较采用 One－way ANOVA分析，检验水准α＝0.05，多样本组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠视网膜病理组织学HE染色比较 通过光学显微镜观察HE染色的大鼠视网膜切片，结果发现，对照组大鼠组织结构清晰，完成，染色较为均匀，神经节细胞排列均匀。糖尿病组大鼠缺损最为明显，神经节细胞减少。氨基胍治疗组大鼠缺损不明显，神经节细胞略少于正常大鼠。见图1。

图1 各组视网膜切片HE染色（×100）

2.2 3组大鼠血清中NOS水平比较 检测结果发现，氨基胍治疗组、对照组iNOS水平显著低于糖尿病组，对照组nNOS水平明显低于其他两组，3组eNOS水平差异无统计学意义（P＞0.05）。氨基胍治疗组与糖尿病组比较，iNOS蛋白表达降低（P＜0.05），与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3组大鼠血清中NOS水平比较s，n＝20，U／mgprot）

表1 3组大鼠血清中NOS水平比较s，n＝20，U／mgprot）

a：P＜0.05，与糖尿病组比较；b：P＜0.05，与对照组比较。

组别iNOS eNOS nNOS糖尿病组 0.393±0.092 0.263±0.051 0.313±0.031b氨基胍治疗组 0.285±0.063a0.257±0.066 0.286±0.043b对照组0.276±0.076 0.249±0.058 0.216±0.074

2.3 3组大鼠NOS蛋白表达比较 Western blot结果显示，对照组大鼠视网膜中iNOS、eNOS、nNOS蛋白表达较低，糖尿病组较高。氨基胍治疗组中iNOS的蛋白表达明显弱于糖尿病组（P＝0.039），与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图2、3。

图2 3组大鼠视网膜中NOS蛋白表达比较

图3 3组大鼠血清中NOS蛋白表达比较

2.4 3组大鼠NOS mRNA表达比较 PT－PCR检测显示，氨基胍可以抑制iNOS mRNA的高表达，对eNOS mRNA和nNOS mRNA的高表达影响不明显，见表2。

表2 各组大鼠NOS mRNA表达比较s，n＝20）

表2 各组大鼠NOS mRNA表达比较s，n＝20）

a：P＜0.05，与糖尿病组比较。

组别iNOS mRNA eNOS mRNA nNOS mRNA糖尿病组1.684±0.280 1.413±0.250 1.553±0.130氨基胍治疗组 1.166±0.130a1.378±0.230 1.399±0.180对照组1.209±0.210 1.105±0.190 1.018±0.210

3 讨 论

DR是一种多因素、多作用途径的糖尿病并发症，严重危害人类生命健康。DR的发生受到多种条件控制，例如视网膜新生血管，细胞凋亡等等［6］，早期糖尿病的研究主要集中在细胞凋亡，细胞凋亡与DR的发病有着密切的联系［7］。研究发现，氨基胍会引起蛋白非酶糖基化终产物（AGEs）增加，AGEs可以通过使Bc－l2／Bax的比例降低以及caspase3的活化，从而引起毛细血管周细胞凋亡［7－8］。同时，氨基胍作为一种NOS抑制剂，对NOS具有显著的抑制作用［8－9］，并有文献报道，氨基胍对DR的治疗作用与抑制NOS有关，但是其抑制作用是否具有NOS亚型选择作用目前并不清楚，需要进一步的研究证实［9－10］。

DR都会引起视网膜细胞的缺损，神经节细胞减少［10－11］，降低视网膜细胞的缺损，增加神经节细胞数量是治疗视网膜病变的主要目的。本研究发现，使用氨基胍的大鼠视网膜细胞缺损情况减轻，神经节细胞明显增多。说明氨基胍可以抑制糖尿病大鼠的视网膜病理性病变。

NOS分为iNOS、nNOS、eNOS 3个亚型［11－12］，它们在体内起到不同的作用。研究发现，糖尿病大鼠视网膜中iNOS mRNA水平明显提高，iNOS阳性细胞数也显著增多，且阳性细胞主要分布在INL［13］。有研究表明，在正常大鼠视网膜中，iNOS免疫反应沉淀物主要出现在INL的 Müller细胞中［12－15］，而此细胞是维系视网膜血管结构的重要的神经胶质细胞［16］。由此可推测iNOS产生的过多的NO有可能对血管造成损伤。因此，抑制iNOS的表达可能对治疗DR具有一定的效果。本研究发现，氨基胍对iNOS的水平及表达具有显著的抑制作用，且具有选择性。

本研究证实了氨基胍可以改善DR，且作用途径与选择性地抑制iNOS有关。对于氨基胍参与多作用途径治疗糖尿病微血管病变提供了试验依据，同时，为研究和开发新型的治疗DR药物起到一定的指导作用。

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