宜昌润楠大、小孢子发生及雌、雄配子体发育的研究

韩逸洋+李利平+陈发菊+杨林森+梁宏伟

摘要：宜昌润楠（Machilus ichangensis）属樟科（Lauraceae）润楠属（Machilus）植物，常绿乔木，是中国传统的珍贵优质用材树种。对宜昌润楠的大、小孢子发生及雌、雄配子体发育过程进行了详细的细胞学观察。结果表明，宜昌润楠的雌蕊子房1室，单胚珠，倒生，双珠被，厚珠心。大孢子母细胞经减数分裂形成直线形排列的4个大孢子，合点端的发育成功能大孢子，其余3个退化，胚囊发育类型为蓼型。雄蕊花药多为二室，少三室、四室花药，变形绒毡层，小孢子四分体排列为四面体型，成熟花粉为二胞花粉。小孢子有少量败育及不育现象，雄性不育株绒毡层细胞延迟降解，使小孢子得不到营养而不能正常发育，最后败育。

关键词：宜昌润楠（Machilus ichangensis）；大、小孢子发生；雌、雄配子体发育；败育

中图分类号：S718.43文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2352-04

The Megasporogenesis，Microsporogenesis，Female and Male Gametophyte Development of Machilus ichangensis

HAN Yi-yang1，LI Li-ping1，CHEN Fa-ju1，YANG Lin-sen2，LIANG Hong-wei1

（1.Biotechnology Research Center，China Three Gorges University，Yichang 443002，Hubei，China；

2.Bureau of Shennongjia National Nature Reserve，Shennongjia 442421，Hubei，China）

Abstract： Machilus ichangensis Rehd.et Wils is an unique high-quality timber species belonging to Lauraceae Machilus. The megasporogenesis，microsporogenesis and development of male and female gametophytes in the flower of Machilus ichangensis were observed at cellular level. The results showed that the ovary of Machilus ichangensi had 1-locules，with single ovule.The ovule was anatropous，bitegmic and crassinucellate with the endothelium.The megaspore mother cell formed a linear tetrad of 4 megaspores after meiosis. The chalazal megaspore developed the functional one and the other 3 at the micropylar pole were degraded. The development of embryo sac was of polygonum type. There were 2-locules，3-locules and 4-locules anther sac in flowers. The tapetum was amoeboid. The microspores tetrad was arranged in a tetrahedral. The mature pollen grains were of 2-celled types. There were little pollen abortion and male sterility since the tapetum of male sterile plants delayed degradation and the microspores could not obtain enough nutrition for normal development.

Key words：Machilus ichangensis；megasporogenesis and microsporogenesis；male and female gametophytes development；abortion

基金项目：国家科技支撑计划课题（2013BAD03B03）

宜昌润楠（Machilus ichangensis）属樟科（Lauraceae）润楠属（Machilus）毛花组中的黄心树亚组[1]常绿阔叶乔木，是中国特有珍稀植物，产于湖北、四川、陕西、甘肃，生长在海拔560～1 400 m的山坡或山谷的疏林内。宜昌润楠不仅树干通直，树姿优美，是良好的观赏绿化树种，且其木材优良，树皮可作褐色染料，种子油可制肥皂、润滑油等，具有潜在的轻工业利用前景。

对宜昌润楠的研究目前仅限于生理生态[2，3]、化学成分[4]的研究，更多的是关于润楠属[5-7]、润楠[8-12] 的分类及雄配子体超微结构的研究。而对宜昌润楠鲜有报道。本研究在前人研究的基础上，对宜昌润楠花发育过程中，大、小孢子发生及雌、雄配子体的形成过程进行了详细的细胞学观察和研究，旨在为该种资源保护、良种繁育和系统进化研究提供生殖生物学方面的基础资料。

1材料与方法

用于细胞学研究的宜昌润楠花芽材料采自湖北省五峰县仁和坪镇。将不同发育时期的宜昌润楠花芽固定于FAA固定液中，固定24 h后转入70%乙醇中保存在4 ℃冰箱备用。采用常规石蜡切片法切片。Laica切片机连续切片，切片厚度为8 μm。番红、固绿对染法进行染色，逐级脱水透明封片，Nikon ECLIPSE 80i型显微镜观察照相。

2结果与分析

2.1小孢子发生及雄配子体的形成

2.1.1花药壁的发育宜昌润楠为圆锥花序，从花药横切面看，雄蕊9枚，外轮6枚，内轮3枚（图1-11）。宜昌润楠的花药有2室花粉囊、3室花粉囊和4室花粉囊，且2室花粉囊居多，有一字型排列花粉囊和蝶形花粉囊（图1-14）。在小孢子造孢细胞时期，花药壁开始分化，依次形成表皮、药室内壁、2～3层中层和绒毡层，细胞之间排列紧密（图1-2）。随着次生造孢细胞的发育，花药壁层次清晰，且绒毡层质浓（图1-3）。当小孢子母细胞形成时，绒毡层细胞体积变大，质浓，细胞形状规则，排列紧密，且中层在早期呈现出退化趋势（图1-4）。在小孢子四分体时期及刚释放的小孢子时期，绒毡层开始脱离花药壁，细胞之间排列疏松，此时中层只剩残迹，表皮细胞与药室内壁细胞仍紧密排列，方形（图1-6）。在小孢子变圆的阶段，小孢子周围出现周原生质团（图1-7，图1-9），包裹着每个小孢子，故宜昌润楠的绒毡层属于变形绒毡层。当小孢子发育成熟时，周原质团已被吸收殆尽，中层仍留残迹，药室内壁开始纤维化，表皮紧贴药室内壁（图1-10）。散粉时期，花药从两侧开裂，花药壁脱落（图1-13）。

2.1.2小孢子发生及雄配子体的形成 在花粉囊壁发育的同时，宜昌润楠的初生造孢细胞发育为次生造孢细胞，次生造孢细胞呈多边形，细胞排列紧密，核大，质浓，有较大液泡位于细胞中央（图1-2）。紧接着次生造孢细胞进一步发育为小孢子母细胞，形状变圆，质浓，细胞核被液泡挤向一边（图1-4）。随后小孢子母细胞进行1次减数分裂，形成正四面体形四分体，排列紧密（图1-5）。四分体释放的小孢子形状不规则，被原生质团绒毡层包围，随后小孢子体积开始增大，形状变圆。在雄配子体发育的过程中，有花粉败育现象，败育的花粉细胞质空瘪，最后只剩下空的花粉壁（图1-7）。可育花粉细胞圆润，单核期细胞质浓，周围外壁仍有胼胝质，小孢子核经过一次有丝分裂，形成成熟的二核花粉，被液泡挤向一边的核叫生殖核，位于细胞中央较大的核为营养核（图1-12）。在切片时发现宜昌润楠少量的雄性不育现象，在四分体释放小孢子后，绒毡层不能脱离花粉囊壁，细胞内的自溶物不能及时为小孢子提供营养，小孢子形状线性，空瘪（图1-15），最后与绒毡层一起降解，形成一条颜色很深的带（图1-16）。

2.2大孢子发生及雌配子体的形成

宜昌润楠子房一室，单胚珠，倒生，双珠被，厚珠心。在早期的珠心组织中，珠心顶端表皮下3～4层细胞分化为2个孢原细胞，核大，质浓（图2-1、图2-2）。随后孢原细胞经过一次平周分裂形成一个造孢细胞和一个周缘细胞，但仅一个造孢细胞分化成为大孢子母细胞。由于胚珠两侧生长速度不一致，不久一侧分裂生长较快的发生弯曲，导致胚珠倒生，内珠被生长快于外珠被（图2-3）。大孢子四分体排列直线型（图2-4），且靠近合点端的一个成为功能大孢子，其余3个退化。随后功能大孢子先形成单核胚囊（图2-5），单核胚囊经过3次有丝分裂分别形成二核胚囊（图2-6）、四核胚囊（图2-7）、八核胚囊（图2-8）。在雌配子体形成的过程中，囊腔逐渐扩大，在成熟胚囊时达到最大（图2-4～9）。由于胚囊中的细胞并不位于同一平面，所以在不同的切片中才能观察到特殊细胞。位于珠孔端的卵细胞体积最大，核大，质浓（图2-9），与2个助细胞成梨形状（图2-10）。中央极核位于胚囊中央（图2-11），反足细胞位于合点端，3个细胞构成“品”字形排列。

3讨论

宜昌润楠为樟科润楠属，其胚胎学特征基本上与樟科和润楠属的胚胎学特征相符合。胚珠倒生，双珠被，厚珠心，大孢子四分体直线型，靠近合点端发育为功能大孢子，胚胎发育为蓼型，与樟科基本特征一致[13-16]。在郭建民等[8]的润楠属胚胎学的报道中孢原细胞起源于珠心表皮3～4层细胞之下，且雌性孢原细胞多个相一致。樟科植物的绒毡层有腺质绒毡层，也有变形绒毡层[13]。而润楠属[9，12]与宜昌润楠的切片中都表现出变形绒毡层的特征，在四分体解体后绒毡层细胞向药室腔内移动，在小孢子周围形成周原质团。基于传统形态学特征，花药室数目曾经被作为樟科分类依据，而现在花药数目是一个可变而缺乏稳定的形态特征，同一属内的不同种类间药室数目也是不稳定的[17]。在Kweon等[13，14]对樟科的报道中指出花药有2室和4室，取决于哪个属哪个科，未见3室报道。而在宜昌润楠中，一朵花中同时存在2室、3室、4室花粉囊，以2室花粉囊居多。这可能跟取材的野生宜昌润楠有关，在属间或种间出现了一定的变异。

从大量切片中观察到，不同花的花粉囊或同一朵花中不同花粉囊发育不同步，在四分体解体后，同一花中的不同药室发育高度同步。雌蕊与雄蕊的发育基本同步。在连续切片中可以看到，小孢子在四分体及之前的时期，数量居多，在小孢子成熟的过程中，有部分败育现象，细胞空瘪，出现异常，最终导致花粉量的减少，有性生殖能力降低。在部分花的发育中仍可见雄性不育现象，在小孢子从四分体释放出来后，绒毡层没有进入到花粉囊中，而在原位延迟降解，导致小孢子过度收缩变形，不能进行正常的液泡化，不能正常地进行有丝分裂而形成空的花粉囊。在雄性不育的报道中，绒毡层的异常通常是其普遍因素。高粱不育系[18]的花药绒毡层细胞存在过度发育和液泡化的异常现象；其次在玉米[19]、萝卜[20]、水稻[21]等雄性不育细胞学研究中也均发现了绒毡层的迟缓消失等异常现象。由此可见，绒毡层不能及时降解致使宜昌润楠的雄蕊在分化过程中出现败育现象，使其繁殖能力低下，也是宜昌润楠种群数量稀少的部分原因。可以进一步通过生物化学、分子生物学等现代生物技术对其进行探究，以探索制约宜昌润楠自我更新繁育的其他关键环节和关键因子或寻找致使其绒毡层自身溶解延迟的相关基因，从而通过人工干预，寻求提高该物种繁育能力的有效方法。

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