植物绒毡层异常导致花粉败育的机理研究进展

罗海山，孟德璇，陈晓阳，罗红兵*

(1湖南农业大学农学院，长沙410128;2中国农业大学农学与生物技术学院，北京100193)

在开花植物中，花粉发育成熟是一个极其复杂的过程，期间涉及到花药原基细胞的分裂分化，花粉母细胞的减数分裂和有丝分裂等过程。花粉的发育依赖于花药壁细胞层尤其是绒毡层细胞的支持。植物的花药一般有呈蝶形的4个花粉囊，每个花粉囊的囊壁从外向内分别是表皮层、药室内壁、中层、绒毡层［1］，花粉小孢子位于花粉囊腔内。

有研究表明，绒毡层细胞发育过程中的任何异常，都可能直接或间接导致花粉粒的败育，形成雄性不育［2，3］。对植物绒毡层细胞发育和分子机理的研究，将有助于更深入的了解花粉发育与雄性不育的分子机理，并利用生物技术创造可供生产中应用的优良雄性不育系。

1 植物绒毡层的功能

植物绒毡层作为花药壁最内层细胞，是向花粉母细胞运输物质的枢纽，对花粉母细胞及后期小孢子的正常发育起着至关重要的作用［4］。

在花粉发育过程中，向花粉小孢子输送营养物质是植物绒毡层最主要的功能之一，绒毡层细胞中的物质被极性转运至向药室面，并分泌到药室中，从而为花粉母细胞减数分裂和花粉小孢子发育提供所需的营养［5］;在小孢子母细胞完成减数分裂形成四分体之后，绒毡层细胞适时的向外分泌胼胝质酶，用以分解四分体之间的胼胝质结构，释放出小孢子细胞［6］。

此外，人们还在绒毡层上发现了乌氏体和绒毡层小体，它们分别在花粉壁和花粉包被的形成过程中起了重要的作用［7，8］。绒毡层的这些功能表明，绒毡层细胞是花粉粒成熟过程中一层极其重要的细胞，它与花粉粒的正常发育有着密切的联系。

2 植物绒毡层异常导致花粉败育的机理

2.1 细胞学机理

周巍等［9］认为，绒毡层细胞最靠近花粉母细胞，花粉母细胞发育所需营养主要来自绒毡层的供给，绒毡层发生异常，必然会引起花粉的发育异常。有研究［10，11］表明，绒毡层异常导致花粉小孢子败育的原因主要是由于绒毡层细胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)造成的;调控绒毡层细胞PCD过程的基因一旦表达出现异常，都可能导致绒毡层细胞提前或者推迟降解，进而影响花粉小孢子的正常发育，最终形成雄性不育［12］。

曹媛等［13］在对毛白杨的研究中发现，绒毡层细胞Ca2+－ATPase的分布异常会影响绒毡层细胞的正常PCD进程，使绒毡层细胞无法正常降解，小孢子发育所需的营养物质得不到及时供应，导致了花粉的败育。戴文懿等［14］发现，在拟南芥的温敏雄性不育突变体atms1中，高温环境会使花药绒毡层PCD进程出现滞后，直到花粉粒发育后期仍无法正常降解，导致其不能产生正常的花粉粒，影响了植株的育性。盛英等［15］在对小麦不育系的研究中发现，由于RAFTIN1基因的提前高表达，导致绒毡层PCD异常而提前降解，小孢子无法得到充足的发育所需营养而形成雄性不育。

除了绒毡层细胞PCD进程异常的原因以外，花粉小孢子败育也可能由于绒毡层细胞本身发育过程中出现异常造成。朱惠霞等［16］在对花椰菜不育系09－R9的试验中发现，该突变体的绒毡层细胞发育异常，花粉囊内无绒毡层形成。许忠民等［17］发现，甘蓝不育系CMS158在花粉母细胞四分体时期绒毡层细胞径向膨大，细胞内含物极少，其营养无法满足自身发育需要，反而通过径向伸长以吸取小孢子四分体中营养，导致小孢子营养流失，不能正常生长发育而形成败育。施展等［18］认为，大白菜不育系6w－9605A的败育原因是绒毡层细胞异常膨大，挤压小孢子，导致小孢子和绒毡层解体。

综上所述，在正常的花药中，绒毡层细胞完全成熟之后，细胞内富含花粉小孢子后期发育所需的各种营养物质，当小孢子从四分体释放出来时，绒毡层便开始降解以提供小孢子发育营养和结构物质［19］，同时也能为花粉粒的完全成熟腾出空间。而PCD异常或者发育异常的绒毡层细胞，则无法正常向小孢子提供发育所需的营养物质，甚至占据了小孢子发育所需的空间，最终导致花粉的败育。

2.2 分子学机理

近年来，随着分子生物学的发展，在拟南芥和水稻等模式植物中鉴定克隆了一些与绒毡层发育相关的基因，使人们更深入的了解到调控植物绒毡层细胞发育过程的分子机制。由图2可见，在花药细胞分化早期，调控绒毡层发育的基因有AG、SPL/NZZ、EMS/EXS、TPD1、BAM1/BAM2以及 MPK3/MPK6 和ER/ERL1/ERL2［20～23］等。Toshiro Ito 等［24］发现，AG(Agamous)作为绒毡层发育早期的调控因子之一，位于SPL/NZZ(Sporocyteless/Nozzle)基因的上游，并通过激活SPL/NZZ基因的表达，共同调控花药的发育;而SPL/NZZ基因编码一个MADS－box转录因子家族的核蛋白，其功能与孢原细胞分化形成初生周缘细胞和初生造孢细胞的过程有关，突变体spl/nzz中的孢原细胞可以形成，但接着的细胞分裂会出现缺陷，导致绒毡层和造孢细胞缺失，造成雄性不育。

图2 绒毡层发育的基因调控网络模式图［19］

Hord等［25］在拟南芥中发现了 BAM1(Barely Any Meristem 1)/BAM2，这对基因主要调控花药发育早期细胞的特异分化，并且推测 BAM1/BAM2与SPL/NZZ可能在花药中协同对造孢细胞和体细胞的数量平衡起正负调控的作用。

EMS1和TPD1对花药发育早期偏后的时期起着调控作用。在拟南芥中，EMS1基因编码了一个LRR－RLK蛋白受体激酶［26］，TPD1基因编码1个含176个氨基酸的小蛋白;这两个基因在细胞中的表达位置并不相同，EMS1主要在绒毡层中表达，而TPD1则主要是在小孢子母细胞中表达，它们的突变体表型类似，均是在花药细胞层出现发育缺陷，突变体的绒毡层细胞被额外形成的小孢子母细胞所取代。Yang等［27］将TPD1基因在拟南芥中过表达时发现，突变体心皮的数目明显增加，而在EMS1突变体中过表达TPD1基因时却没发现相同的变化，这证明了TPD1和EMS1可能在同一条调控途径中起作用。

SERK1(Somatic Embryogenesis Receptor－Like Kinase 1)和SERK2基因编码了一个LRR型的受体蛋白激酶，双突变体表型为绒毡层缺失，产生较多小孢子母细胞，与ems1和tpd1的突变表型相类似，推测可能与EMS1和TPD1有比较相似的调控途径［28］。Hord等［29］对 ER 家族(ER，ERL1，and ERL2)和MPK3(Mitogen－Activated Protein Kinase 3)/MPK6的研究中发现，这两个基因家族的突变体也是在绒毡层的发育过程中出现了一层异常的细胞，然而在这类突变体中，EMS1和TPD1的表达均不受影响，所以推断MPK3/MPK6和ER/ERL1/ERL2在绒毡层细胞的发育中可能有其独立的调控途径。

DYT1(DYSFUNCTIONAL TAPETUM 1)是绒毡层发育中期表达的bHLH类型的转录因子，与水稻中的UDT1(UNDEVELOPED TAPETUM1)基因高度同源。Zhang等［30］研究发现，该基因位于 SPL/NZZ、EMS/EXS等基因调控途径的下游，主要在绒毡层中表达，表达高峰期在花粉母细胞减数分裂早期和后期，突变体的绒毡层液泡化严重且不能降解，且小孢子母细胞减数分裂异常，无法形成正常的胼胝质壁，导致不能形成正常的小孢子。

TDF1(TAPETAL DEVELOPMENT AND FUNCTION1)、AMS(ABORTED MICROSPORES)、MYB103、MS1(MALE STERILITY 1)是调控绒毡层后期发育的4个主要转录因子。基因表达分析表明［19］，TDF1基因的作用位于AMS和MYB103基因的上游，DYT1的下游，该基因编码了一个MYB家族转录因子，其突变体绒毡层细胞在发育的第7期高度液泡化，无法形成分泌型细胞，后期小孢子被挤在花粉囊中间且无法降解导致花粉败育。

AMS与水稻中的TDR(TAPETUM DEGENERATION RETARDATION)基因同源，编码了一个MYC类的转录因子，主要在花粉母细胞减数分裂后期的绒毡层细胞中表达，突变体表现为绒毡层细胞肥大、降解推迟导致的花粉不育［31］。

Zhang等［32］发现，MYB103 基因与绒毡层中胼胝质的降解以及花粉外壁的形成相关，通过对MYB103的表达分析发现，MYB103调控着MS2和A6启动子的表达，其作用域位于MS1的上游。MS1基因通过编码具有PHD－finger结构域的蛋白，调控绒毡层细胞和小孢子的发育，ms1突变体由于绒毡层发育异常，不能正常降解导致小孢子从四分体释放后，无法形成正常的花粉壁而退化降解［33］。

3 其他影响绒毡层发育的相关基因

在水稻、油菜、玉米等其他大田作物中，也陆续报道了一些与绒毡层发育相关的基因。

在水稻中，Osc6、OsOPT9、MTR1等基因都与花药绒毡层发育相关。Zhang等［34］研究发现，Osc6是TDR下游一个基因，在第9期到第11期的绒毡层和小孢子中特异表达，参与了绒毡层内脂类物质前体向其它花药组织的运输过程，水稻OsOPT9基因位于第八号染色体上，同源分析显示它属于水稻寡肽运输家族，突变体花粉败育是由于小孢子母细胞发育时期花药的绒毡层过早脱落降解造成的［35］。MTR1是2012年由Tan等［36］克隆出来的一个水稻不育基因，它编码了一个含有Fasciclin结构域的分泌性的糖蛋白，研究发现，该基因虽然在花粉母细胞中特异表达，却影响了绒毡层细胞的发育，导致绒毡层细胞无法正常降解。

曾芳琴等［37］对油菜 SB45A不育系的研究发现，油菜BnCYP704BJ基因与孢粉素的合成有关，该基因的突变会导致绒毡层中脂类物质代谢的紊乱造成不育。夏秀云［1］推测，甘蓝型油菜的不育相关基因BnATA20可能受TPD1的调控，突变体表现为绒毡层膨大挤压小孢子，导致花粉败育。

MAC1是调控玉米绒毡层形成及发育的一个重要基因，mac1突变体表现为绒毡层缺失，本应发育为绒毡层的细胞层被小孢子母细胞取代，由于绒毡层的缺失，小孢子母细胞不能完成减数分裂，最终没有花粉产生［38］。

4 小结与展望

植物绒毡层细胞在花粉粒发育成熟过程中扮演着举足轻重的角色，尽管目前人们对绒毡层的发育过程以及结构功能研究比较多，但是对其分子机理的了解还在探索中，比如绒毡层的PCD的精确调控机制还有待进一步研究，绒毡层异常产生大量液泡的作用机制还缺乏直接的分子生物学证据。

随着生物科学技术的发展，对绒毡层机理研究的不断深入，可以利用基因工程等成熟的技术条件，创造人工雄性不育系，来克服常规育种中时间上的局限性。前人研究［39］表明，将烟草中绒毡层的特异启动子基因T29与外源基因Barnase(胞外核糖核酸酶)嵌合，在绒毡层中表达可以破坏绒毡层细胞，从而获得雄性不育材料。目前该技术在烟草［40］、葡萄［41］、菜心［42］、甘蓝［43］等作物上均有成功的例子。通过基因工程的方法来创建不育系，具有快速、高效、简便等优势，不仅大大缩短了育种的周期，也节省了人力物力，在以后的育种工作中必将有着广泛的应用前景。

［1］夏秀云.甘蓝型油菜雄性不育相关基因BnATA20功能验证［D］.华中农业大学，2011.

［2］宋江华，张立新.植物花粉发育的基因工程研究进展［J］. 中国农学通报，2008，24(12):92 －95.

［3］Huang MD，Hsing YI，Huang AH.Transcriptomes of the anther sporophyte:availability and uses［J］.Plant Cell Physiol，2011，52(9):1459 －1466.

［4］Pacini E.Tapetum character states:analytical keys for tapetum types and activities［J］.Can J Bot，1997，75(9):1448－1459.

［5］张英涛，杨海东，陈朱希昭.绒毡层研究进展［J］.植物学通报，1996，13(4):7 －14.

［6］谭何新，文铁桥，张大兵.水稻花粉发育的分子机理［J］. 植物学通报，2007，24(3):330－339.

［7］李懿星，李 莉，陈光辉.高等植物花药绒毡层发育研究进展［J］. 作物研究，2009，23(5):287－289.

［8］罗鑫娟，刘旭昊，王新宇.绒毡层小体，一种在花药绒毡层细胞中新发现的含油细胞器［J］.细胞生物学杂志，2006，28(1):61 －65.

［9］周 巍，许 明.不结球白菜细胞核雄性败育过程的细胞学研究［J］. 安徽农业科学，2007，35(6):1600－1601.

［10］Sanders PM，Lee PY，Biesgen C，et al.The Arabidopsis DELAYED DEHISCENCE1 gene encodes an enzyme in the jasmonic acid synthesis pathway ［J］.Plant Cell，2000，12(7):1041 －1061.

［11］Varnier AL，Mazeyrat－Gourbeyre F，Sangwan RS，et al.Programmed cell death progressively models the development of anther sporophytic tissues from the tapetum and is triggered in pollen grains during maturation ［J］.J Struct Biol，2005，152(2):118 －128.

［12］张 虹，梁婉琪，张大兵.花药绒毡层细胞程序性死亡研究进展［J］.上海交通大学学报:农业科学版，2008，26(1):86 －90.

［13］曹 媛，康向阳，张志毅，等.毛白杨花粉败育过程中Ca2+－ATPase的异常变化［J］.北京林业大学学报，2012，34(4):10 －17.

［14］戴文懿，孙亚梅，高 贝，等.拟南芥温敏雄性不育突变体atms1的获得及表型分析［J］.上海大学学报:自然科学版，2011，17(5):681 －686.

［15］盛 英，张改生，李亚鑫，等.小麦生理型雄性不育花药绒毡层和孢粉素变化与RAFTIN1表达的关系［J］.中国农业科学，2011，44(19):3937 －3944.

［16］朱惠霞，陶兴林，胡立敏.花椰菜细胞质雄性不育系的细胞学研究［J］.中国蔬菜，2011，(18):64－67.

［17］许忠民，张恩慧，程永安，等.甘蓝胞质雄性不育系CMS158小孢子发生的细胞学研究［J］.西北农业学报，2012，21(3):118 －121.

［18］施 展，万正杰，徐跃进，等.大白菜新型细胞质雄性不育系6w－9605A的育性鉴定和花药败育的细胞学观察［J］. 植物科学学报，2012，30(1):49－54.

［19］Zhu J，Chen H，Li H，et al.Defective in tapetal development and function 1 is essential for anther development and tapetal function for microspore maturation in Arabidopsis［J］.Plant J，2008，55(2):266 －277.

［20］Schiefthaler U，Balasubramanian S，Sieber P，et al.Molecular analysis of NOZZLE，a gene involved in pattern formation and early sporogenesis during sex organ development in Arabidopsis thaliana［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(20):11664 －11669.

［21］Yang SL，Xie LF，Mao HZ，et al.Tapetum determinant1 is required for cell specialization in the Arabidopsis anther［J］.Plant Cell.2003，15(12):2792 －2804.

［22］Zhao DZ，Wang GF，Speal B，et al.The excess microsporocytes1 gene encodes a putative leucine－rich repeat receptor protein kinase that controls somatic and reproductive cell fates in the Arabidopsis anther［J］.Genes Dev，2002，16(15):2021 － 2031.

［23］Wilson ZA，Zhang DB.From Arabidopsis to rice:pathways in pollen development［J］.J Exp Bot，2009，60(5):1479－1492.

［24］Toshiro Ito，Wellmer F，Yu H，et al.The homeotic protein agamous controls microsporogenesis by regulation of SPOROCYTELESS［J］.Nature，2004，430:356 －360.

［25］Hord CL，Chen C，Deyoung BJ，et al.The BAM1/BAM2 receptor－like kinases are important regulators of Arabidopsis erly anther development［J］.Plant Cell，2006，8(7):1667－1680.

［26］Zhao DZ，Wang GF，Speal B，et al.The excess microsporocytes1 gene encodes a putative leucine－rich repeat receptor protein kinase that controls somatic and reproductive cell fates in the Arabidopsis anther［J］.Genes Dev，2002，16(15):2021 － 2031.

［27］Yang SL，Jiang L，Puah CS，et al.Overexpression of TAPETUM DETERMINANT1 alters the cell fates in the Arabidopsis carpel and tapetum via genetic interaction with excessmicrosporocytes1/extra sporogenouscells［J］.Plant Physiol，2005，139(1):186 － 191.

［28］Albrecht C，Russinova E，Hecht V，et al.The Arabidopsis thaliana SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR－LIKE KINASES1 and 2 control male sporogenesis［J］.Plant Cell，2005，17(12):3337 － 3349.

［29］Hord CL，Sun YJ，Pillitteri LJ，et al.Regulation of Arabidopsis early anther development by the mitogen－activated protein kinases，MPK3 and MPK6，and the ERECTA and related receptor－ like kinases［J］.Mol Plant，2008，(4):645－658.

［30］Zhang W，Sun Y，Timofejeva L，et al.Regulation of Arabidopsis tapetum development and function by DYSFUNCTIONAL TAPETUM1(DYT1)encoding a putative bHLH transcription factor［J］.Development，2006，133(16):3085－3095.

［31］Sorensen AM，Krber S，Unte US，et al.The Arabidopsis aborted microspores(AMS)gene encodes a MYC class transcription factor［J］.Plant J，2003，33(2):413－423.

［32］Zhang ZB，Zhu J，Gao JF，et al.Transcription factor At-MYB103 is required for anther development by regulating tapetum development，callose dissolution and exine formation in Arabidopsis［J］.Plant J，2007，52(3):528 －538.

［33］Wilson ZA，Morroll SM，Dawson J，et al.The Arabidopsis MALE STERILITY1(MS1)gene is a transcriptional regulator of male gametogenesis，with homology to the PHD － finger family of transcription factors［J］.Plant J，2001，28(1):27 －39.

［34］Zhang D，Liang W，Yin C，et al.OsC6，encoding a lipid transfer protein，is required for postmeiotic anther development in rice［J］.Plant Physiol，2010，154(1):149－162.

［35］刘 滔，夏快飞，曾纪晴，等.水稻OsOPT9基因的在花药发育中的作用研究［A］.见:中国遗传学会，等.2011年全国植物生物学研讨会论文集［C］.2011.

［36］Tan H，Liang W，Hu J，et al.MTR1 encodes a secretory fasciclin glycoprotein required for male reproductive development in rice［J］.Dev Cell，2012，22(6):1127－1137.

［37］曾芳琴.油菜S45AB隐性核不育分子机理与应用研究［D］.武汉:华中农业大学，2010.

［38］Sheridan WF，Golubeva EA，Abrhamova LI，et al.The mac1 mutation alters the developmental fate of the hypodermal cells and their cellular progeny in the maize anther［J］.Genetics，1999，153(2):933 －941.

［39］Hartley RW.Barnase and barstar:two small proteins to fold and fit together［J］.Trends Biochem Sci，1989 ，14(11):450－454.

［40］韩凤英，韩学智，邹 敏，等.BcA9－Barnase转基因雄性不育烟草的获得［J］.西南大学学报(自然科学版)，2012，34(4):58 －64.

［41］杨丽娜，刘 捷，庄智敏，等.根癌农杆菌介导Barnase基因转化‘美人指’葡萄的研究［J］.南京农业大学学报，2009，32(1):31 －35.

［42］曹必好，孟成民，雷建军，等.TA29－barnase基因转化菜心［J］. 生物工程学报，2008，24(5):881－886.

［43］朱玉英，龚 静，吴晓光，等.甘蓝转 TA29－Barnase基因植株的花器特征及育性分离的初步研究［J］.上海农业学报，2001，17(1):79 －82.