有机磷酸酯对青海弧菌Q67毒性的构效关系

姜丹，周建国，李娜，饶凯锋，李晓，胡毅，马梅

1. 河南师范大学化学化工学院，新乡 453007 2. 中国科学院高能物理研究所核分析技术重点实验室，纳米生物效应与安全性重点实验室，北京 100049 3. 河南师范大学环境学院，黄淮水环境与污染防治教育部重点实验室，新乡 453007 4. 中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室，北京 100085

有机磷酸酯对青海弧菌Q67毒性的构效关系

姜丹1,2，周建国3,*，李娜2,4,#，饶凯锋4，李晓4，胡毅2，马梅4

1. 河南师范大学化学化工学院，新乡 453007 2. 中国科学院高能物理研究所核分析技术重点实验室，纳米生物效应与安全性重点实验室，北京 100049 3. 河南师范大学环境学院，黄淮水环境与污染防治教育部重点实验室，新乡 453007 4. 中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室，北京 100085

有机磷酸酯；发光菌；定量构效

有机磷酸酯类化合物(OP)不仅广泛应用于农药[1-2]，还被用于增塑剂、医药制剂、阻燃剂以及军事工业等领域[3]。该类化合物的广泛使用也带来不可忽视的环境问题，一些有机磷酸酯类化合物易溶于水，一旦进入江河之中，可以很容易对水生生态系统造成污染，从而增大了水生动植物的敞口风险[4]。如今被人们利用的有机磷酸酯类化合物的种类较多，人们对其危害性也进行了一定的研究，前人多以研究有机磷酸酯类的农药，例如敌敌畏、辛硫磷、久效磷和二嗪农等的急性毒性以及其对乙酰胆碱酯酶的抑制作用为主[5-7]。但是，应用于其他行业的有机磷酸酯类化合物的毒性报道较少，例如应用较多的用于阻燃剂的磷酸三甲酯、磷酸三乙酯、磷酸三丙酯、磷酸三甲苯酯等。有机磷酸酯是以添加方式加到材料中的，这使其进入水生态环境的几率增大[8]。例如，污水处理工艺中，由于使用的塑料制品含有大量有机磷酸酯，其可在水流的作用下释放，使出水口有机磷酸酯的浓度提高[9]。韩国和澳大利亚等国家在污水处理厂也检出了有机磷酸酯[10-11]。目前，我国关于非农药类的有机磷酸酯的研究主要还是集中在合成和使用方面，而关于其对水生态环境的污染研究仍然较少，因此，亟需对有机磷酸酯进行水生生物的毒性研究。

有机磷酸酯类化合物种类较多，通过对有机磷酸酯的毒性效应进行检测并构建定量构效关系模型(quantitative structure-activity relationships，QSAR)，可以对其进行毒性预测及机理解释。目前，利用QSAR来分析毒性实验结果并对同类物质的毒性进行预测，已是毒理学研究的领域中很重要的分析方法，可用于研究污染物生态毒理效应及环境行为与分子结构的内在关联，也可降低实验的费用，并且机理明确的QSAR 有助于对实验数据不确定性进行评价。

本研究选用发光菌中的青海弧菌Q67(Vibrio qinghaiensis sp. -Q67)来检测所选用样品的毒性。发光细菌生物毒性测试法由于反应快速、灵敏度高和经济等优点得到广泛关注[12]。正常的生理活性条件下，发光细菌可发出肉眼可见的蓝绿色光[13]。当外界环境发生变化或存在污染物干扰时均能使发光细菌的发光强度变化，其发光强弱与毒性物质的浓度成一定比例关系[14]。青海弧菌Q67是一种淡水发光菌[15]，该发光菌能在淡水中发光，对盐离子的浓度要求不高，可广泛应用到环境污染监测中，在淡水污染物毒性评价中的优势明显[15-16]。许多国内研究者利用青海弧菌Q67对取代酚类[16-17]、重金属[18]等环境污染物进行了急性毒性的研究，已取得较好的效果。本研究所采用的建模方法为偏最小二乘(partial least square regression，PLS)回归分析方法[19]，该方法更容易识别噪声与系统信息，可将多个因变量同时进行建模，并且在样本的容量少于变量的个数时也可回归建模[20]。

本研究选择了15种常见有机磷酸酯类化合物作为研究对象，结合微孔板高通量检测技术，研究了有机磷酸酯类化合物对青海弧菌Q67的毒性，同时采用偏最小二乘方法构建QSAR模型并对其可能的毒性机制进行解释。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 主要仪器和试剂

仪器：Infinite M200 酶标仪(TECAN)、恒温振荡摇床(HZQ-F，哈东联)、恒温平板摇床(Titramax 1000，Heidolph，Germany)、百级超净工作台(DL-CJ-1F，哈东联)、旋涡混合器(MS2，广州 IKAWorks)。

试剂：15种有机磷酸酯类化合物均购自美国 Sigma-Aldrich 公司，化合物的结构和纯度见表1。

表1 15种常见有机磷酸酯的结构Table 1 The parameters of 15 organophosphates

1.2 实验菌种

本实验选用的青海弧菌Q67由华东师范大学惠赠，在生态环境研究中心长期保存并选育，测试方法参见相关文献[21]。

1.3 分子结构描述符

本研究采用PLS进行回归建模，选用了最低空轨道能级(LUMO，eV)、极化率(P)、正辛醇/水分配系数(logD)、芳香环个数(NAr)、氢键受体个数(NA)、氢键供体个数(ND)和分子表面积(TSA)等七种分子结构描述符为QSAR研究的因子，七种分子结构描述符均由Gaussian 03[22]软件计算得到。15 种有机磷酸酯的分子结构描述符见表 2。

1.4 有机磷酸酯类对Q67发光菌的毒性测试

有机磷酸酯类对Q67发光菌的毒性测试参照文献[21,23-24]实验方法进行。取低温条件下保存的Q67 菌种转入新鲜的斜面上，22 ℃ 条件下恒温培养 24 h，然后将菌种接入装有液体培养基的锥形瓶内，于22 ℃条件下，振荡(180 r·min-1)培养16～18 h，2000 r·min-1下离心10 min，收集菌体，用模拟湖水将菌体制成菌悬液。调整菌悬液的密度，使其发光强度在200～600万RLU之间，待用。实验前，用人工配置的实验溶液(模拟湖水，化学组成接近天然湖水)稀释样品所对应的12个几何级数浓度梯度，将其加入96孔微板中，模拟湖水设为空白对照，样品的每个浓度设置3个平行。震荡20 min后，用酶标仪测定各孔的发光强度(RLU)，以空白对照的 RLU的均值(I0)和各浓度的3个平行样的 RLU的均值(I)计算样品对发光菌发光的相对抑制率x(%)，每块板重复3次以减少随机误差。其中，x(%)=(1-I/I0)×100%模拟湖水配方：4.2 mg KCl、11.1 mg CaCl2、28.6 mg MgSO4、42.0 mg NaHCO3、4.2 g NaNO3溶于1 L蒸馏水，121 ℃条件下高压灭菌20 min。

2 结果(Results)

2.1 15种常见有机磷酸酯对Q67发光菌的毒性

根据Q67发光菌的毒性数据，分别用OriginPro 8拟合了15种有机磷酸酯与Q67发光菌的剂量-效应关系，如图1。依据拟合的剂量-效应曲线，可以得到15种有机磷酸酯的EC50、EC20以及相关系数(r)，结果见表3。从表3中可以看出，有机磷酸酯的EC50在1.13×10-5～3.27×10-3mol·L-1之间。

表2 有机磷酸酯类化合物的分子结构描述符Table 2 Molecular descriptors of organophosphates

表3 15种常见有机磷酸酯的logistic函数拟合结果Table 3 Fitting results of logistic functions for 15 organophosphates

图1 15种常见有机磷酸酯的剂量-效应曲线Fig. 1 Dose-response curves for 15 organophosphates

2.2 15种磷酸酯类化合物对Q67发光菌毒性的QSAR研究

从15种有机磷酸酯类化合物中随机选取12种组成训练集，其余3种作为验证集，将训练集中的12种机磷酸酯类化合物的-logEC50值作为因变量，运用软件SIMCA-P 6.0中的PLS创建模型[25]，主成分分析结果如表4。其中，最优模型如下：

-logEC50=2.979+0.246P+0.220logD+0.204NAr+0.186TSA-0.129LUMO-0.084NA+0.080 ND

表4 QSAR模型得到的有机磷酸酯-logEC50的实测值与预测值Table 4 Observed and predicted values of -logEC50 for organophosphates from QSAR model

注：* 验证集中的化合物。 Note: * compounds for validation set.

图2 15种常见有机磷酸酯-logEC50的实测值与预测值的拟合图Fig. 2 Plot of observed against predicted -logEC50 values for 15 organophosphates

3 讨论(Discussion)

3.1 污染物对Q67发光菌的致毒机制

有报道称[26]，污染物对发光菌的毒性效应主要有两个途径决定：(1)参与发光反应的酶类活性；(2)生物代谢的过程。而有机磷酸酯类化合物作为反应性有机化合物，其分子活性中心可对发光菌中的荧光素酶及其辅酶作用产生毒性效应，林志芬[27]通过实验也验证了发光菌体内污染物的毒性是由污染物的活性中心作用于发光菌中的荧光素酶及其辅酶而产生，而不是作用于其他生物大分子。黄素单

核苷酸在发光菌发光的过程中起着重要的辅酶作用，而且其还原形式(FMNH2)中的-NH和-OH基团都在暴露位点，污染物通过脂溶作用在发光菌的细胞类脂蛋白膜上聚集后，还可再通过分子中的-NO2、-OH和-NH2等氢键的给予体或接受体与黄素单核苷酸的还原形式(FMNH2)结合产生氢键进一步增大污染物对Q67发光菌的急性毒性效应[28]。虽然污染物可通过脂溶性在细胞类脂蛋白膜上聚集，但是洪晖等人[29]推测，对于单细胞微生物的发光菌，其含有较少的类脂，因此污染物的脂溶性不能决定其对发光菌毒性的大小，而是由污染物的活性中心作用于发光菌中的酶来决定。苏丽敏[30]也认为污染物的脂溶性对发光菌的急性毒性效应贡献较小。

3.2 有机磷酸酯类化合物的构效关系分析

本研究中的模型引入的主成分及预测变量分别为1个和7个，如表5所示。可以看出PLS 主成分在P、logD、NAr、TSA上的载荷值比较大，该4个变量的投影性指标，即VIP值较大，表明对-logEC50值的影响显著。

由最优模型回归系数及表5可知，P、logD、NAr和TSA对PLS的主成分贡献大，并且与-logEC50值成正相关关系。而LUMO、NA和ND也有一定程度的贡献。

分子极化率P，是对电介质的极化特性进行描述的微观参数。P值越大，越容易产生范德华力。Wang等人[31]利用QSAR模型研究了苯砜基环烷酸酯类化合物对明亮发光杆菌的毒性效应，研究表明，P值越大，苯砜基环烷酸酯类化合物的毒性越强。苏丽敏[28]通过QSAR建模的研究表明，分子中含有基团(如-Cl、-OR等)的电负性越强并且越多时，化合物的P值越大，越容易与受体蛋白分子产生分子间作用力，并且随作用力的增强，对受体的毒性越大。这可以很好地解释本实验研究的有机磷酸酯类化合物，当其取代基的电负性基团越多电子云密度越大时，中心原子给电子能力增强，对Q67发光菌的毒性效应越大。由本实验研究测试的磷酸酯类化合物的-logEC50值知，磷酸三甲酯、磷酸三乙酯、磷酸三丙酯和磷酸三丁酯4种有机磷酸酯化合物随着P值的增大，对Q67发光菌的急性毒性效应也就越强。含有羟基的磷酸二丁酯和双(2-乙基己基)磷酸酯对Q67发光菌的急性毒性效应大小也与P值正相关。对于亚磷酸酯类化合物，结构相似的亚磷酸三丁酯、三异丙基亚磷酸酯和亚磷酸二苄酯、亚磷酸二苯酯对Q67发光菌的急性毒性效应随P值的增大而增强，与实验测试结果一致。含有苯环结构的亚磷酸三苯酯和亚磷酸二苯酯对Q67发光菌的急性毒性效应大小也与P值正相关。而卤素取代的2-溴乙基磷酸二乙酯由于-Br的存在，可使P值增大，其急性毒性效应大于与其结构、组成相似的磷酸三乙酯。因此，本研究证明分子极化率P在有机磷酸酯类污染物对发光菌的急性毒性中发挥重要作用。

表5 变量在QSAR模型中的VIP及PLS权重Table 5 VIP and PLS weights of variable for QSAR model

注：W*1为权重；VIP为投影性指标。

Note: W*1, PLS weights; VIP, values of the variable importance in the projection.

正辛醇/水分配系数logD，是疏水性参数，为化合物在正辛醇相与水相的浓度之比。可反映化合物的脂溶性大小[32]，其可影响细胞膜对化合物的吸附、累积及界面传输的过程，同时也会影响化合物与酶蛋白的结合。logD越大，化合物的脂溶性越大，越较易穿过细胞膜，进而使Q67发光菌的毒性效应增大。本研究中结构非常相近的磷酸三甲酯、磷酸三乙酯、磷酸三丙酯与磷酸三丁酯随着logD的增大其对发光菌的急性毒性也随之增大。对于含有羟基的磷酸二丁酯和双(2-乙基己基)磷酸酯，双(2-乙基己基)磷酸酯的logD高于磷酸二丁酯，对Q67发光菌的急性毒性效应也强。亚磷酸酯类化合物中，亚磷酸三丁酯的logD值大于三异丙基亚磷酸酯，其对Q67的急性毒性效应也就越大。由此可看出，对于发光菌，尽管其含有较少的类脂，但是污染物的脂溶性对发光菌的急性毒性效应也有一定贡献。林志芬等人[27]的实验也验证了脂溶性对发光菌的急性毒性效应有一定贡献。这点与苏丽敏[30]、洪晖等人[29]的观点有所不同， 还有待进一步的实验证明。

芳香环个数NAr，是化合物中含有的芳香环数目，邹立和汝少国等人[33-34]认为含有苯环结构的有机磷酸酯的毒性强，其他取代基与苯环形成的离域大π键越大，电子云密度越大，苯环结构越稳定，有机磷酸酯的毒性也就越强。本研究也发现芳香环数越多，有机磷酸酯对发光菌的急性毒性越大。如亚磷酸酯类化合物中的亚磷酸三丁酯、亚磷酸二苯酯和亚磷酸三苯酯对Q67发光菌的急性毒性效应随着苯环个数的增多而增强。磷酸三苯酯对Q67发光菌的急性毒性效应大于其他几种只含有脂肪链的磷酸酯类化合物的结果也说明了苯环结构的存在对毒性效应影响显著。

分子表面积TSA，是QSAR研究中的一个重要描述变量，与正辛醇/水分配系数有很好的相关性，TSA越大，越容易与生物体接触进入细胞体内，对Q67发光菌的急性毒性效应就越强，这与Wilson等人[35]研究的四十多种化合物的毒性结果相一致。本实验研究测试的磷酸三甲酯、磷酸三乙酯、磷酸三丙酯和磷酸三丁酯四种有机磷酸酯化合物随着TSA值的增大，对Q67发光菌的急性毒性效应也就越强。含有羟基的磷酸二丁酯和双(2-乙基己基)磷酸酯对Q67发光菌的急性毒性效应大小也与TSA值正相关。对于亚磷酸酯类化合物中结构相似的亚磷酸三丁酯、三异丙基亚磷酸酯和亚磷酸二苄酯、亚磷酸二苯酯，其对Q67发光菌的毒性效应随TSA值的增大而增强，与实验测试结果一致。

分子的最低空轨道能LUMO，是电性参数，为能级最低且未占有电子的轨道，韩香云认为[36]LUMO越小，含硫芳香羧酸酯衍生物对发光菌的毒性越大，LUMO与化合物的电子亲和能相关，LUMO越小，分子越较易接受电子，并与亲核试剂发生反应，最终导致毒性增强，本研究也证实了有机磷酸酯的毒性与LUMO成反比。NA和ND分别反映化合物分子同其他基团形成氢键时所能接受或给出质子氢的个数，NA和ND越多，与发光菌受体中的-OH、-NH或=O、O-等越易于形成氢键而增强化合物的毒性，而本研究结果表明NA和ND对有机磷酸酯的毒性有一定的贡献。

综上所述，本研究所检测的有机磷酸酯类化合物均对Q67发光菌有急性毒性效应。结合QSAR研究发现，P、TSA、logD和NAr对有机磷酸酯的急性毒性的贡献较大，且与毒性(-logEC50)正相关。对于结构、组成相似并且只含有脂肪链的磷酸酯和亚磷酸酯化合物，P、TSA和logD值越大，其对Q67发光菌的急性毒性效应也越强。含有苯环结构的磷酸酯和亚磷酸酯化合物，芳香环NAr个数越多对Q67发光菌的急性毒性效应也就越强。卤取代有机磷酸酯化合物，由于卤素的电负性较强，增加了化合物的P值，即卤素的存在使污染物对Q67发光菌的急性毒性效应增强。利用偏最小二乘方法对有机磷酸酯类急性毒性构建的QSAR 模型预测能力较好、稳定性较高，并且无过拟合的现象，能用来预测有机磷酸酯对Q67发光菌的毒性效应。

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◆

QuantitativeStructure-ActivityRelationshipsbetweenAcuteToxicityofOrganophosphatesandVibrioqinghaiensissp. -Q67

Jiang Dan1,2, Zhou Jianguo3,*, Li Na2,4,#, Rao Kaifeng4, Li Xiao4, Hu Yi2, Ma Mei4

1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China 2. Key Laboratory for Biomedical Effects of Nanomaterials and Nanosafety, Multi-discipline Initiative Center, Institute of High Energy Physics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3. Key Laboratory of Yellow River and Huai River Water Environment and Pollution Control, Ministry of Education, College of Environment, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China 4. State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

29 January 2013accepted18 April 2013

organophosphates; Vibrio qinghaiensis sp. -Q67; QSAR

国家高技术研究发展计划(863计划) 2012AA06A302；国家自然科学基金20871042；教育部高等学校博士学科点专项科研基金 20104104110004；河南省教育厅自然科学研究基金 2011A150019和2008B430012

姜丹(1985-)，女，硕士，研究方向：环境污染物对发光菌的急性毒性研究; E-mail: jiangdan.110@163.com；

*通讯作者(Corresponding author), E-mail: zhoujgwj@sina.com

10.7524/AJE.1673-5897.20130129001

2013-01-29录用日期：2013-04-18

1673-5897(2014)1-071-10

： X171.5

： A

周建国(1963—)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事无机功能材料和环境化学研究。李娜(1982—)，女，博士，助研，主要从事环境毒理方面的研究。

#共同通讯作者(Co-corresponding author), E-mail: linazone@163.com

姜丹，周建国，李娜，等. 有机磷酸酯对青海弧菌Q67毒性的构效关系[J]. 生态毒理学报, 2014, 9(1): 71-80

Jiang D, Zhou J G, Li N, et al. Quantitative structure-activity relationships between acute toxicity of organophosphates and Vibrio qinghaiensis sp. -Q67 [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(1): 71-80 (in Chinese)