PM2.5暴露对大鼠行为学及器官的急性毒理作用

李 峰,石 辉

西安建筑科技大学环境与市政工程学院,西安,710055

在不同的生理和病理状态下,机体的内稳态按照一定规律发生相应的变化,在污染环境中运动会影响机体的运动能力,造成特异性、非特异性免疫的损害[1]。且运动强度越大,呼入的颗粒物越多,对机体健康的危害越大[2]。卒中指数是评判缺血性脑卒中后大脑损伤程度的重要依据,它对神经系统功能缺损的评定起着重要作用[3]。同时机体抗氧化-免疫系统的变化也可以作为机体生理反应、疲劳程度的依据。研究认为,多种细胞因子的活性改变是运动引起免疫功能变化的内在机制[4],而细胞因子的过度和不适当表达会引起一系列疾病[5]。因此,本实验通过测定不同浓度PM2.5暴露下运动大鼠行为学、抗氧化及免疫指标的变化,探讨PM2.5暴露对运动状态下机体的急性毒理作用及其可能的机制。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 PM2.5的采样及悬液制备

用TH-150C型(武汉天虹)大容量大气总颗粒物智能采样器(配加2.5 μm的切割器)进行 PM2.5的采样,采样时间持续30 d,每天连续采样24 h。采样地点为某体育馆内,周围无障碍物遮挡且为非污染源,采样前将采样仪器放置高度为1.5 m,即人体呼吸带高度,采用同心圆方式选取5个点,两点之间相距5 m左右,离墙 ＞1 m、离门窗 ＞3 m,空气流量为 1.13 m3·min-1。采样时将已称重的滤膜用镊子放入结晶采样夹的滤网上,滤膜毛面朝进气方向,将滤膜压紧至不漏气。采样结束以后用镊子取出滤膜,将有尘面两次对折放入样品纸袋并做好采样记录。将滤膜放在25℃,50%相对湿度的恒温恒湿箱中平衡24 h,在此平衡条件下用感量为0.01 mg的分析天平称量滤膜,记录滤膜质量,然后将同一滤膜再恒温恒湿箱中同样的条件下再平衡1 h后称重,两次重量之差小于0.04 mg为满足恒重要求。根据采样前、后滤膜质量差和采样体积得出颗粒物的质量浓度。

悬液制备:将载有PM2.5的滤膜裁剪为小块,浸入去离子水中,超声振荡30 min×4次,洗脱颗粒物,震荡液经6层纱布过滤,滤液4℃ 1 000 rm·min-1离心20 min后收集下层悬液冷冻,PM2.5在-20℃保存。染毒时,用0.9%生理盐水配制成需要的浓度,使用前超声振荡混匀,灭菌备用。为保证颗粒物的实际毒性效果,未对颗粒物进行消毒灭菌处理。

1.2 仪器与试剂

仪器:电动跑台(中国杭州段氏制作公司);DK-98-1A恒温浴锅(天津泰斯特有限公司);TN-100托盘扭力天平(武汉自动化仪表厂);Bonso-TCS-2000A电子称(武汉自动化仪表厂);MR23i型低温高速离心机(美国Thermo公司);TH-150C型大容量大气总颗粒物智能采样器(武汉天虹);BECKMAN AD 340化学发光酶标仪(美国)。

试剂:GSH-Px和ROS试剂盒购自南京建成生物工程研究所,NF-κΒ和MCP-1试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3 实验动物分组与运动方案

实验大鼠选用健康成年雄性SPF级Wistar大鼠32只,由西安交通大学医学院动物房提供(实验动物生产许可证号为:SCXK(陕)2012-003),鼠龄7周,体重180～220 g。大鼠购入后适应性喂养一周,自由进食饮水(饲料购自西安交通大学医学院动物房,生产厂家为西安秦乐饲料有限公司),动物饲养室内温度(20～26)℃,湿度为44% ～70%,照明随同自然变化。实验中对大鼠的处置按照中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求进行[6]。将所有大鼠随机分为EC,LPE,MPE和HPE,按照每千克体重3 mL的剂量进行设计。实验动物每组8只,适应性喂养一周后,所有大鼠先以 10 m·min-1、5 min·d-1的跑台运动进行2 d的适应性训练,休息1 d后即按照设定的运动方案进行一次递增负荷训练,具体训练方案为:15 m·min-1×15 min,18 m·min-1×20 min,21 m·min-1×30 min,24 m·min-1×40 min,27 m·min-1×50 min的递增负荷形式进行。

1.4 实验动物染毒剂量与染毒方式

PM2.5染毒采用气管滴注法,滴注前受试动物的温度维持在37℃左右。具体染毒时间为训练前1 h,在乙醚麻醉后,染毒悬液预温至37℃,经气管注入PM2.5颗粒物染毒悬液,滴注体积为 3 mL·(kg·bw)-1[7],注入后立即将大鼠直立并旋转,使颗粒物尽量均匀分布,对照组滴注同等容量的生理盐水。

1.5 组织匀浆制备及指标测试

大鼠在运动结束后即可处死,称取适量肺、肝脏、股四头肌组织加入0.9%的生理盐水,按W(g):V(mL)=1:9的比例加取预冷的匀浆介质(pH 7.4,0.01 mol·L-1Tris-HCL,0.0001 mol·L-1EDTA-2 Na,0.01 mol·L-1蔗糖,0.8%的NaCl溶液)于烧杯中,用眼科小剪尽快剪碎组织块(以上全部操作在冰水浴中进行),然后倒入研钵中按照顺时针方向进行研磨至糊状。匀浆液通过二层纱布过滤后按试剂盒要求分别于低温冷冻离心机4 000 rpm·min-1离心l0 min,分离上清液,4℃冰箱保存备用或冷藏或-20℃冰箱冰冻备用,使用前按照试剂盒要求作相应的稀释。

指标测试:GSH-Px和ROS采用分光光度计法,NF-κΒ和MCP-1采用ELISA法。

卒中指数评分[8]:总分25分,0～3分为症状组,3～9分为中间组,可能有损伤,≧10分为明显有损伤。毛发脏乱颤抖:1分;运动减少或迟钝:1分;耳触觉迟钝:1分;头翘起:3分;眼固定状睁开:3分;后肢外展呈“八”字:3分;上睑下垂:1分;转圈:3分;惊厥或爆发运动:3分;极度衰弱:6分。

1.6 统计学分析

实验结果采用SPSS 13.0统计软件处理,采用独立样本t检验,计算均值士标准差,确定差异的显著性。

2 结果(Results)

2.1 PM2.5暴露对运动大鼠行为学的影响

数据显示,与EC相比,LPE,MPE和HPE组大鼠的卒中得分随着暴露浓度的增加而升高,差异具有统计学意义(P＜0.01),见表1。

2.2 PM2.5暴露对肺组织 GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1影响

表2显示,与EC相比,3种浓度PM2.5暴露后GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1数值随着暴露浓度的增大而呈剂量效应关系变化,其中GSH-Px活性下降且MPE组差异具有统计学意义(p＜0.01),ROS,NF-κΒ,MCP-1上升差异有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01),见表2。

2.3 PM2.5暴露对肝脏组织 GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1的影响

由表3中数据可知,和 EC比较,PM2.5暴露后GSH-Px活性下降,MPE,HPE组差异有统计学意义(p＜0.05或P＜0.01);ROS含量升高,差异具有统计学意义(p＜0.05);NF-κΒ升高差异均具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);MCP-1上升,MPE,HPE组差异有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01),所有指标变化呈剂量相关性变化,见表3

表1 PM2.5暴露对运动大鼠行为学的影响(n=8)Table 1 Effects of PM2.5exposure on behavior of exercise rats(n=8)

2.4 PM2.5暴露对股四头肌组织GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1的影响

实验数据表明,股四头肌组织GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1的变化和其它器官表现出一致性,即和EC比较,GSH-Px活性随着PM2.5暴露浓度的升高而下降;但ROS,NF-κΒ和MCP-1随着暴露浓度的增加而升高,差异均具有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01),见表 4。

3 讨论(Discussion)

3.1 PM2.5暴露对运动大鼠行为学的影响

卒中指数是评判缺血性脑卒中后大脑损伤程度的重要依据,也是评价机体对应激反应后行为学的指标。适宜的应激水平可以调节机体的内稳态,降低应激引起的皮质醇水平,缓解应激造成的行为功能减弱状况。但较大的应激水平则会造成行为学及某些生理生化指标的紊乱。本实验结果显示,和运动组比较,大鼠的卒中得分随着暴露浓度的增加而升高,差异具有统计学意义,最明显的症状表现在运动减少或迟钝以及头翘起,其次为毛发脏乱颤抖,高浓度组的部分大鼠还出现极度衰弱症状。应激反应是一个十分复杂的过程,机体对应激的调节作用与个体的健康状况、运动方式、运动强度、暴露方式和暴露浓度有关。本实验的结果说明,高浓度的PM2.5暴露会对大鼠的行为学反应造成不良的影响。结合本实验的抗氧化及免疫数据可知,造成这种现象发生可能是因为PM2.5触发或者加剧了机体氧化能力,破坏了氧化-抗氧化系统的平衡,同时免疫能力的降低也许是其中的一个机制。另外,卒中的发生伴有细胞内外信息传递的一系列变化,兴奋性氨基酸作用于突触后受体介导的Ca2+超载也许是其产生的原因之一(文章尚未发表)。但PM2.5暴露是否会造成运动情绪低落从而导致卒中指数升高还需进一步探讨。

3.2 PM2.5暴露对不同组织GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1影响

流行病学和毒理学研究表明,PM2.5的暴露与人体呼吸系统、免疫系统、心血管系统疾病等健康问题密切相关[9-10]。大气PM2.5气管滴注染毒后可引起哮喘、支气管炎、肺部和心血管等疾病[11]。而在对抗颗粒物污染的防御屏障中,机体的抗氧化及免疫系统可以借助抗氧化酶和多种免疫介质参与细胞间的相互作用和信息传递,从而对机体生理过程进行经常性的细胞保护和免疫调节。运动可影响人体抗氧化、免疫应答,而这些应答又依赖于运动的强度、间隔时间和运动负荷。在运动应激状态下,氧化-抗氧化-免疫网络的动态平衡是维持机体内环境稳定的途径之一。肺组织是血液氧气交换的器官,是机体防御的初级屏障[12],肝脏作为机体重要的解毒器官,可以减弱有毒物质的危害,而股四头肌作为运动中血液主要聚集的器官,可以加速血液循环,从而具备载体的作用。

表3 PM2.5暴露对肝脏组织GSH-Px，ROS，NF-κΒ，MCP-1的影响 (n=8)Table 3 Effects of PM2.5exposure on GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1 of liver tissue(n=8)

表4 PM2.5暴露对股四头肌组织GSH-Px，ROS，NF-κΒ，MCP-1的影响 (n=8)Table 4 Effects of PM2.5exposure on GSH-Px,ROS,NF-κΒ,MCP-1 of quadriceps muscle tissue(n=8)

本实验3种组织中GSH-Px活性均在PM2.5暴露后呈下降趋势,且呈剂量相关反应,表明PM2.5对运动机体的抗氧化能力有损伤作用;同时活性氧浓度的升高也证实了机体的氧化能力超过了抗氧化系统的缓冲范围。细颗粒物在运移和传输过程中可吸附有害气体、重金属元素、有机污染物以及病毒、细菌等物质,而这些有毒物质可进入呼吸道深处,影响肺泡巨噬细胞的吞噬能力,导致免疫功能下降[13]。同时细颗粒物可通过诱发细胞内产生过量自由基或活性氧,并使细胞抗氧化能力下降而引起细胞膜脂质过氧化[14]。运动时肺通过增加肺通气量和加速代谢来满足机体的需求,但同时肺通气量的增加也会加速PM2.5的摄取和转运。大运动量的持续运动导致骨骼肌产生大量的活性氧,作为细胞内主要含硒的抗氧化酶GSH-Px,迅速缓冲活性氧的毒性,然而若机体产生的自由基超过抗氧化酶的缓冲能力时,活性氧会与GSH-Px活性产生竞争性抑制,导致细胞GSH-Px的含量及酶活性降低,酶的还原功能减弱,进而导致氧化应激损伤。PM2.5由肺部进入体内,与肺上皮细胞和肺巨噬细胞接触并相互作用释放出大量的细胞因子和活性氧(ROS),这些ROS以及颗粒物本身携带的自由基穿过气血屏障随血液循环进入器官,造成组织内氧化与抗氧化系统的平衡失调。

不同刺激诱导细胞产生的内源性活性氧可以作为第二信使,通过改变氧化还原状态调节与细胞增殖、分化及凋亡相关的信号转导通路中多种靶分子的活性,最终决定细胞的命运。NF-κΒ的活化在急性肺损伤的发生发展中起重要作用[15],活性氧的产生是对氧化还原敏感的转录因子NF-κΒ的诱导因素之一,这也许是PM2.5染毒后NF-κΒ升高的一个原因;除了活性氧,细胞氧化状态也能够直接激活NF-κΒ的信号传导和基因表达,导致细胞外病理生理改变[16]。以前的关于抗氧化剂研究表明,NF-κΒ的激活是氧化敏感的,通过调节氧化/抗氧化的平衡可以调节其改变[17]。

MCP-1是具有趋化单核细胞和激活单核细胞的双功能细胞因子,当机体防御系统遭破坏时,MCP-1则在损伤部位可大量表达,通过一定的信号传导途径在机体防御、炎症恢复和抗肿瘤等方面起重要作用[18-19]。在本实验中 PM2.5染毒后 NF-κΒ和 MCP-1的同时升高说明了二者的协同作用,其机制可能是PM2.5作用机体后产生的一系列因素综合作用的结果,比如氧化应激、信号传导、细胞因子的产生、脂质过氧化等[20]。由于MCP-1在急性组织损伤中发挥着重要的作用,是构成早期抵御微生物侵入的防线,因此MCP-1的升高可以看做是机体对PM2.5毒性刺激的一种保护性反应。

综上所述,我们认为:(1)本实验中PM2.5暴露可以显著降低运动大鼠的行为反应能力和主观驱动性;(2)不同浓度PM2.5染毒后大鼠部分器官的抗氧化系和免疫统平衡受到破坏,且各指标的变化与PM2.5浓度呈剂量反应关系。

致谢:感谢四川大学康启智和陕西师范大学生命科学学院杨瑾博士的帮助和支持。

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