凝胶渗透色谱-高效液相色谱荧光法测定脂溶性天然色素中特丁基对苯二酚

,,,，*

(1.晨光生物科技集团股份有限公司,邯郸 057250；2.河北省天然色素工程技术研究中心,邯郸 057250)

凝胶渗透色谱-高效液相色谱荧光法测定脂溶性天然色素中特丁基对苯二酚

孙建玲1,2,杨清山1,2,张玉芬1,高伟1,2，*

(1.晨光生物科技集团股份有限公司,邯郸 057250；2.河北省天然色素工程技术研究中心,邯郸 057250)

建立了脂溶性天然色素中特丁基对苯二酚(TBHQ)的检测方法。样品经凝胶渗透色谱(GPC)技术去除色素和脂类,高效液相色谱荧光法进行定性、定量分析。加标水平为0.5～1.5mg/kg时,TBHQ的回收率为85.50%～103.33%,相对标准偏差为1.06%～7.04%。方法检出限0.1mg/kg。本方法具有净化效果好,准确灵敏,回收率高等优点,适用于脂溶性天然色素中特丁基对苯二酚的检测。

凝胶渗透色谱,高效液相色谱荧光法,特丁基对苯二酚,脂溶性天然色素

特丁基对苯二酚(TBHQ)作为一种有效的抗氧化剂,常被添加到油脂和富脂食品中[1-3],但是大量食用TBHQ会有致畸、致癌的风险,所以TBHQ的使用量受到严格限制和严格监控。目前,TBHQ检测主要针对食用油、工业用油、富脂食品和食品包装材料等,尚未发现对脂溶性天然色素如辣椒红和叶黄素等中TBHQ含量检测方法的报道。因此开发脂溶性天然色素中TBHQ的检测方法是十分必要的。国内外TBHQ的检测手段主要有气相色谱法[4-5]、高效液相色谱法[6-7]和质谱法[8-9],其中气相色谱法灵敏度较低,易受杂峰干扰；质谱法特异性强,但成本高使之不能广泛应用。高效液相色谱荧光法具有特异性强、灵敏度高和成本低的优点,适用于TBHQ的检测分析。在前处理方面,目前采用的是传统柱层析法和有机试剂反复提取法,操作繁琐,实验周期长。本实验采用的凝胶渗透色谱(GPC)以多孔凝胶为固定相,利用分离物分子量大小不同而达到分离目的,具有操作简单、快捷等优点,对于富含脂肪、色素和蛋白质等样品的净化具有明显优势[10-11]。

本实验采用GPC进行样品前处理,高效液相色谱-荧光法测定脂溶性天然色素中TBHQ的含量,极大提高了检测灵敏度,具有良好的适用性,为脂溶性天然色素中TBHQ含量的测定提供了一种可靠的分析手段。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

环己烷(分析纯,重蒸)；乙酸乙酯(分析纯,重蒸)；甲醇(色谱纯)；乙酸(色谱纯)；TBHQ(分析纯,99%,CAS.No:1948-33-0)。

高效液相色谱系统Agilent 1260型,配有荧光检测器 安捷伦科技有限公司；凝胶渗透色谱仪J2 Preplinc 普利泰科仪器)；旋转蒸发器R201BL 上海申生科技有限公司；万分之一天平AUY220 岛津；超声波清洗机TH600 济宁天华超声电子仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1标准溶液的配制 准确称取100mg TBHQ标准品,以色谱甲醇溶解并定容至100mL,配制成浓度为1000μg/mL标准储备液,置4℃冰箱中保存,有效期为7天。精密称取标准储备液适量,用色谱甲醇稀释至所需浓度,浓度分别为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/mL,现用现配。

1.2.2 样品制备

1.2.2.1 辣椒红 称取混合均匀的辣椒红1.0000g,用重蒸后的GPC流动相(1∶1,V/V)定容至10mL,振荡或超声溶解后过0.45μm滤膜至GPC进样管中,待GPC净化。

1.2.2.2叶黄素油 称取叶黄素油1.0000g,后按1.2.2.1进行。

1.2.2.3 GPC净化 用乙酸乙酯-环己烷(1∶1,V/V)作为GPC流动相,流速为4.7mL/min,检测紫外吸收波长为254nm,流动相收集时间25-35min。将收集的滤液旋蒸近干,用1.0 mL色谱甲醇溶解,后过滤膜进行液相检测。

1.2.3 标准曲线的绘制 将标准系列浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/mLTBHQ标准溶液进行HPLC检测,记录色谱图；以TBHQ溶液浓度(μg/mL)为横坐标X,HPLC测定的TBHQ的响应面积为纵坐标Y,所得回归方程,即为标准曲线。

1.2.4 精密度考察 取同批次加标水平为1.0mg/kg辣椒红和叶黄素油样品,经GPC前处理后连续5次测定进行精密度实验。根据样品结果计算本方法的精密度。

1.2.5 重现性考察 取同批次加标水平为0.5mg/kg辣椒红和叶黄素油样品各5份,净化处理后作重复性实验,评价结果的重现性。

1.2.6 回收率考察 取辣椒红和叶黄素油样品,分别加入TBHQ标准品至0.5、1.0和1.5mg/kg三个水平。每浓度平行三样本,按1.2.2操作后完成样品制备。在确定的色谱条件下进行HPLC测定,计算日内回收率。连续考察3d,计算日间回收率。

1.2.7 稳定性考察 对加标水平为1.0mg/kg的辣椒红、叶黄素油样品连续5天进行TBHQ含量测定,作TBHQ在样品中的稳定性考察。

1.2.8 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm,3.5μm)；流动相A为1.0%乙酸水溶液,流动相B为乙腈,VA∶VB=60%∶40%等度洗脱；流速1.0mL/min；柱温40℃；进样量20μL；最大激发波长λex为293nm,最大发射波长λem为332nm。

1.2.9. 分析样品 在相同液相色谱条件下,对系列标准溶液和样品溶液进行测定,以保留时间定性,以样品响应峰面积和标准峰面积比较定量。

2 结果与分析

2.1净化方式

GPC能有效去除样品中油脂和色素等大分子的干扰,可用于脂质和色素含量较高的基质的净化。本研究采用GPC净化脂溶性色素样品。辣椒红、TBHQ标准溶液和加入TBHQ标准品后的辣椒红的紫外色谱图见图1。结果表明,脂类和大多数色素在前25min内流出GPC柱(图1A),TBHQ在25～35min流出(图1B)。绝大多数辣椒红可与TBHQ有效分离,收集25-35min内样品可获得净化后的目标物(图1C)。

图1 辣椒红和TBHQ GPC图Fig.1 Gel permeation chromatography of paprika red and TBHQ(20μg/mL)注:A:辣椒红GPC图；B:TBHQ(20μg/mL)GPC图； C:加标后辣椒红GPC图。

2.2流动相的选择

对于TBHQ的测定,一般采用乙腈、甲醇和水作为流动相在反相C18色谱柱上进行色谱分离。本实验分别以乙腈、甲醇和乙腈-甲醇(1∶1,V/V)为流动相进行样品测定发现,乙腈为流动相可使相应信号最强。水相中加入乙酸可优化峰形[12-13],防止峰拖尾现象。当乙酸浓度低于0.5%时,有色谱峰拖尾现象；乙酸浓度大于5%时,仪器损害较大。实验表明,采用1%乙酸可获得理想的峰形。等度流动相1%乙酸水-乙腈溶液即可有效分离杂质与TBHQ峰,适用于TBHQ的检测。

表1 检测精密度结果Table 1 Precision of method

表2 重现性实验结果Table 2 Reproducibility of method

表3 样品回收率结果Table 3 Recoveries in paprika red and lutein

2.3稳定性考察

在实验进行中我们发现,随着测定天数的增加,相同浓度的TBHQ标准溶液的响应峰面积有下降趋势。这意味着TBHQ随时间延长会不断消耗。将TBHQ标准储备液与空白辣椒红和叶黄素油混合均匀,连续5d进行TBHQ含量测定发现,叶黄素油中的TBHQ含量存在明显降低现象。在辣椒红中,TBHQ的消耗并不明显,这与样品本身的性质相关。叶黄素油中叶黄素晶体成分本身是一种抗氧化剂,较辣椒红更易被氧化,因此TBHQ在叶黄素油中的抗氧化保护作用更明显,损耗较快。为保证检测准确性,提取TBHQ后检测应及时进行,并出具稳定性检测数据。

2.4方法学考察

2.4.1 线性关系和检出限 采用1.2.3节的条件进行HPLC分析。在0.05～10.0μg/mL范围内线性方程为Y=61.655X-2.6936,相关系数R2=0.9999。根据3倍信噪比得出方法检出限为0.1mg/kg。相比高效液相色谱紫外检测法检出限0.5～5.0mg/kg[3,14],气相色谱法检出限5.0mg/kg[7],本方法检测TBHQ的灵敏度很高。

2.4.2 精密度实验 加标水平为1.0mg/kg的空白辣椒红和叶黄素油样品中TBHQ精密度测定结果见表1。精密度实验中辣椒红的相对标准偏差为1.37%,叶黄素油的相对标准偏差为1.22%。本方法测定TBHQ具有良好的检测精密度。

2.4.3 重现性实验 加标水平为0.5mg/kg辣椒红和叶黄素油样品中TBHQ含量重现性测定结果见表2。重现性实验中辣椒红的相对标准偏差为5.06%,叶黄素油的相对标准偏差为4.53%。因此,本方法检测TBHQ具有较好的重复性。

2.4.4 回收率实验 在选定的色谱条件下,对未检出TBHQ的辣椒红和叶黄素油分别添加TBHQ标准溶液至0.5、1.0和1.5mg/kg三个水平。按所确定的提取、净化以及检测条件进行加标回收率实验。回收率结果见表3。

由表3可知,辣椒红中TBHQ的平均回收率在85.50%～97.94%,日内相对标准偏差为2.09%～5.22%,日间相对标准偏差在1.17%～7.04%。叶黄素油中TBHQ的平均回收率在92.37%～103.33%,日内相对标准偏差为1.65%～5.37%,日间相对标准偏差在1.06%～5.75%。本方法良好的回收率和准确性。

2.4.5 稳定性实验 对辣椒红、叶黄素油样品中TBHQ含量稳定性考察结果见表4。TBHQ在叶黄素油中有明显损耗,而在辣椒红样品中的消耗并不明显。因此测定TBHQ时,为保证检测准确性,应提供稳定性检测数据。

2.4.6 样品检测 利用本方法分别对3组不同批次的辣椒红和叶黄素油进行分析。检测结果表明两种样品共6批次在9.354min均未出现目标峰(图2B),因此确定产品辣椒红和叶黄素油中TBHQ含量低于检出限。对辣椒红色素和叶黄素油样品进行加标,在9.354min有明确TBHQ峰出现(图2C),TBHQ目标峰与辣椒红中的杂质峰或特征峰得到很好地分离,可完成TBHQ的准确测定,见图2。

表4 稳定性实验结果Table 4 Stability of TBHQ in paprika red and lutein

图2 TBHQ色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of TBHQ注:A:TBHQ标准品的色谱图(含量10μg/mL,保留时间为 9.354min)；B:辣椒红中TBHQ测定谱图； C:加标后辣椒红中TBHQ测定谱图。

3 结论

本研究结果表明,利用凝胶渗透色谱净化系统对脂溶性天然色素进行样品前处理,在保证较高回收率和精密度的前提下可用于测定脂溶性天然色素中TBHQ的含量。确定了色谱条件:色谱柱为Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm,3.5μm)；流动相A为1.0%乙酸水溶液,流动相B为乙腈,以A∶B为60∶40比例等度洗脱；流速1.0mL/min；柱温40℃；进样量20μL；最大激发波长为293nm,最大发射波长为332nm。结果显示TBHQ的线性范围为0.05～10.0μg/mL(R2=0.9999)精密度小于5%,重复性和回收率较好。方法具有灵敏度高,操作简便等优点,为脂溶性天然色素中TBHQ含量的测定提供了可靠的分析手段。

[1]L I Merrill,OA Pike,LV Ogden,etal. Oxidative stability of conventional and high-oleic vegetable oils with added antioxidants[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society,2008,85(8):771-776.

[2]Li XQ,Ji C,Sun YY,etal. Analysis of synthetic antioxidants and preservatives in edible vegetable oil by HPLC/TOF-MS[J]. Food Chemistry,2009,113(2):692-700.

[3]C André,I Castanheira,JM Cruz,etal. Analytical strategies to evaluate antioxidants in food:a review[J]. Trends in Food Science & Technology,2010,21(5):229-246.

[4]Yang MH,Lin HJ,Choong YM. A rapid gas chromatographic method for direct determination of BHA,BHT and TBHQ in edible oils and fats[J]. Food Research International,2002,35(7):327-633.

[5]Xiong Z,Wang L,Li N,etal. Determination of antioxidant residues in polymer food package using gas chromatography][J]. Se pu=Chinese journal of chromatography/Zhongguo hua xue hui,2011,29(3):273.

[6]Chen M,Hu X,Tai Z,etal. Determination of four synthetic phenolic antioxidants in edible oils by high-performance liquid chromatography with cloud point extraction using tergitol TMN-6[J]. Food Analytical Methods,2013,6(1):28-35.

[7]Yang J,Fang C,Yang D. Simultaneous determination of three antioxidants BHA,BHT and TBHQ in food by liquid chromatography and gas chromatography[J]. Wei sheng yan jiu=Journal of hygiene research,2013,42(1):114-118.

[8]Ding M,Zou J. Rapid micropreparation procedure for the gas chromatographic-mass spectrometric determination of BHT,BHA and TBHQ in edible oils[J]. Food chemistry,2012,131(3):1051-1055.

[9]Hao PP,Ni JR,Sun WL,etal. Determination of tertiary butylhydroquinone in edible vegetable oil by liquid chromatography/ion trap mass spectrometry[J]. Food Chemistry,2007,105(4):1732-1737.

[10]Zhu Y,Zhao B,Xiao R,etal. Simultaneous determination of 14 oil-soluble synthetic dyes in chilli products by high performance liquid chromatography with a gel permeation chromatography clean-up procedure[J]. Food chemistry,2014,145:956-962.

[11]KR Riihinen,T Gödecke,GF Pauli. Purification of berry flavonol glycosides by long-bed gel permeation chromatography[J]. Journal of Chromatography A,2012,1244:20-27.

[12]J Rappsilber,Y Ishihama,M Mann. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization,nanoelectrospray,and LC/MS sample pretreatment in proteomics[J]. Analytical chemistry,2003,75(3):663-670.

[13]N Sugiyama,T Masuda,K Shinoda,etal. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications[J]. Molecular & Cellular Proteomics,2007,6(6):1103-1109.

[14]B Saad,YY Sing,MA Nawi,etal. Determination of synthetic phenolic antioxidants in food items using reversed-phase HPLC[J]. Food Chemistry,2007,105(1):389-394.

Determination of tert-butylhydroquinone in fat-soluble pigments by gel permeation chromatography and high performance liquid chromatography with fluorometric detector

SunJianling1,2,YangQingshan1,2,ZhangYufen1,GAOWei1,2，*

(1.Chenguang Biotech Group Co.,Ltd.,Handan 057250，China;2.Hebei Engineering Technology Research Center of Natural Pigments,Handan 057250,China)

A novel method was developed for the determination of tert-butylhydroquinone(TBHQ)in fat-soluble pigments using gel permeation chromatography(GPC)and high performance liquid chromatography with fluorometric detector. The average recoveries of TBHQ were 85.50%～103.33%,spiked at the level of 0.5～1.5mg/kg. The relative standard deviations were in the range of 1.06%～7.04%,and the procedure allows the detection of 0.1mg/kg. The method was rapid,precise and high efficient. It can be extended to the analysis for TBHQ in fat-soluble pigments.

gel permeation chromatography;high performance liquid chromatography with fluorometric detector;tert-butylhydroquinone;fat-soluble pigments

2013-12-27 *通讯联系人

李艳(1982-)，女，博士研究生，助理研究员，研究方向: 生物活性物质功效及应用。

广东省科技计划项目(2011B010500006);广东省高等职业院校珠江学者岗位计划资助项目(2011)。

TS207.3

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001