Bacillus cereus SG03 10L发酵罐中产胞外胆固醇氧化酶发酵条件优化

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(1.安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000；2.皖南医学院微生物与免疫学教研室,安徽芜湖 241000)

BacilluscereusSG0310L发酵罐中产胞外胆固醇氧化酶发酵条件优化

葛飞1,龚倩1,张慧敏1,黄寅1,石贝杰1,桂琳2,*

(1.安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000；2.皖南医学院微生物与免疫学教研室,安徽芜湖 241000)

目的:优化菌株BacilluscereusSG03在10L发酵罐中产胆固醇氧化酶的工艺条件,为该菌株的进一步应用提供依据。方法:在10L发酵罐中,通过单因素实验,分别考察了培养液起始pH、搅拌速率、溶解氧(DO)浓度对BacilluscereusSG03产胞外胆固醇氧化酶的影响。结果:较佳的发酵条件为培养液起始pH6.8、搅拌速率250r/min、溶解氧(DO)浓度80%。在此基础上,对发酵过程进行了两阶段DO控制,发酵前20h DO控制在90%,然后调整为20%,直至发酵结束。较单一DO控制,最大胞外胆固醇氧化酶产量、生产效率分别提高了30.2%和20.0%,达到了1.38U/mL和0.03U/(mL·h)。

蜡状芽孢杆菌,胆固醇氧化酶,发酵罐,两段溶解氧控制

胆固醇氧化酶(COD)是一种双功能的黄素酶,能够催化胆固醇氧化为胆甾-4-烯-3-酮,在许多细菌中都发现具有此酶[1-2]。胆固醇氧化酶在医学[3]、农业[4]和生物催化[5]方面有着广泛的应用。

国内外学者对微生物来源的胆固醇氧化酶的特性、结构、应用和基因克隆等方面进行了大量研究,并取得了不少成果[6]。桑吉等采用超声波联合亚硝基胍的复合诱变方法处理胆固醇氧化酶产生菌(甾短杆菌),使其产酶能力提高了140%,酶活达到了1.21U/mL[7]。许晓燕等对Brevibacteriumsp. 产胆固醇氧化酶的发酵条件及其酶学性质进行了研究,在最适条件下,胆固醇氧化酶的酶活力达到24.01U/mg[8]。王琼等对一株红球菌属胆固醇氧化酶高产菌株的分子生物学鉴定及酶学特性的研究[9]。Sun Y等研究表明,通过对COD活性中心保守序列区域内的氨基酸残基进行定点突变,可有效提高突变酶的热稳定性[10]。

本文在摇瓶实验研究的基础上,获取最佳培养基配方和乳化剂后,进一步考察了培养液初始pH、搅拌速率和DO对BacilluscereusSG03在10L发酵罐中产胞外COD的影响,为该菌株进一步扩大生产COD提供了实验数据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1 菌种BacilluscereusSG03由安徽工程大学生物工程教研室筛选、保藏。

1.1.2 主要试剂 蒽酮,胆固醇,4-安基-安替比林,TritonX-100购自国药集团化学试剂有限公司；辣根过氧化物酶购自美国Sigma公司。

1.1.3 培养基(g/L) 斜面培养基:牛肉膏 5,蛋白胨 10,NaCl 5,琼脂 20,pH自然；

种子培养基:葡萄糖 20,牛肉膏 5,蛋白胨 10,NaCl 5,pH自然；

发酵培养基:葡萄糖 2,胆固醇2,蛋白胨 4,K2HPO40.2,MgSO4·7H2O 0.05,FeSO4·7H2O 0.01,CH3COONH42,NaCl 1,吐温80 3,CaCl20.1,pH自然。

1.1.4 主要仪器设备 BIOTECH-10JSA 3L-10L发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；QHZ-123B组合式全温度振荡培养箱 江苏省太仓市华美生化仪器厂；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；HH-6数显恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司；L5型紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;L550型台式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；TG16-W微量高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 10L发酵罐培养条件 10L发酵罐按6.5L装液量将发酵培养基加入发酵罐,121℃灭菌30min,冷却至30℃,将活化好的摇瓶种子液按3%的接种量接入发酵罐,培养温度33℃,通气量1∶1～1∶1.3,搅拌转速200～350r/min,起始pH自然,培养时间56h。在此基础上,考察起始pH、搅拌速率、DO等因素对SG03菌株发酵过程的影响。

1.2.2 胆固醇氧化酶活力的测定 按照参考文献[11]进行COD酶活测定。酶活力显色体系:4-氨基-安替比林1.4mmol/L,苯酚7mmol/L,磷酸钾缓冲液50mmol/L(pH=7.0),辣根过氧化物酶6U/mL,胆固醇lmmol/L,Triton X-100 l%。

酶活定义:每分钟催化生成1mmol H2O2所需酶量为一个活力单位。标准曲线确定:取酶活力显色体系3mL于试管中,37℃保温3min,分别加入浓度为2.5mmol/L的H2O2溶液50、100、150、200、250μL,反应5min后测OD500值。

酶活测定:取显色体系溶液3mL于试管中,37℃保温3min,加入0.1mL酶液,37℃准确反应10min,沸水浴加热3min终止反应,冷却后测OD500。

酶活计算公式:酶活=0.1996×X×V×K/T,式中:X为反应液的吸光度A500；V为反应液总体积(mL)；K为酶液稀释倍数；T为反应时间(min)。

1.2.3 DO值控制 发酵液 DO通过溶氧电极来检测(以一定条件下溶解氧量相对于饱和溶解氧量的百分比来表示)。

1.2.4 生物量的测定 用真空泵和抽滤瓶对一定量的发酵醪进行抽滤,用蒸馏水反复冲洗3次菌体后,收集湿菌体置于55℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒重后,准确称重,得菌丝干重(生物量)。

生物量(g/L)=菌丝体重量(g)/发酵液体积(L)

1.2.5 发酵过程中相关参数的计算

菌体平均生长速率=(最大生物量-接种量)/(接种量×获得最大生物量的培养时间)；

COD生产率=净最大COD产量/获得最大COD产量的培养时间。

1.2.6 估算菌体比生长速率(μ)和产物比生产速率(ρ) 估算μ和ρ,参照文献[12-13]。根据μ和ρ的定义:

式(1)

当时间间隔很小时,可以近似用式(2)估算得到μ和ρ:

式(2)

式(1)和(2)中,μ:比生长速率；ρ:产物比生产速率；X:生物量；P:COD产量。

因此,根据实验数据可以用式(2)直接估算得到不同培养时刻的μ和ρ。

1.2.7 数据处理方法 所有实验数据均为3次重复实验结果的平均值。采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1BacilluscereusSG03在10L发酵罐中生物量、胞外COD酶活变化情况

在1.2.1的发酵条件下,SG03生物量和胞外COD酶活变化如图1所示。

图1 SG03 10L发酵罐中生物量和酶活变化曲线Fig.1 The curve of biomass and enzyme activity of COD in the broth of SG03 in a 10L fermentor

由图1可以看出,生物量、胞外COD酶活均呈现先增大后减小的趋势,生物量在发酵第36h出现最大值,为14.08g/L；COD酶活在发酵第40h出现最大值,为1.14U/mL。酶活最大值的出现比生物量最大值滞后4h。在发酵第12h后,生物量增加趋势变大,这一时期持续到第36h左右,此后生物量开始下降,第48h后下降趋势进一步加大。

在发酵前16h,COD酶活增加比较缓慢,16h以后产酶水平增加比较明显,在发酵第40h时,酶活出现最大值,随后呈降低趋势。在发酵第56h,胞外COD酶活仅为0.99U/mL,比最高酶活降低了13.2%。

2.2培养液起始pH对SG03产胞外COD的影响

pH是微生物发酵过程中重要参数之一,它对细胞生长和代谢产物的合成有重要影响。摇瓶实验结果表明,培养液起始pH为6.5～7.0范围内时较有利于胞外COD的合成。为了进一步了解pH对10L发酵罐中SG03产胞外COD的影响,本文考察了在10L发酵罐中培养液起始pH分别为5.8、6.3、6.8、7.5和8.0时对胞外COD合成的影响,结果如图2所示。

图2 pH对产胆固醇氧化酶的影响Fig.2 The effect of pH on enzyme activity of COD in the broth

由图2可见,除起始pH为8.0时胞外COD酶活最大值出现在发酵的第36h外,其他条件下均出现在第40h。初始pH为5.8、6.3、6.8、7.5和8.0时,发酵过程中COD最高酶活分别为1.03、1.09、1.14、0.93和0.48U/mL,说明SG03菌株于10L发酵罐中在中性偏酸的环境下更有利于发酵液中COD的积累,因此,培养液的较佳初始pH确定为6.8。

2.3搅拌速率对COD产生的影响

发酵罐培养过程中,过低的搅拌速率会使DO降低,不利于菌体的生长和代谢产物的合成；过高的搅拌速率又会造成发酵液产生大量气泡,导致发酵液逃逸,影响菌体生长代谢,甚至引起染菌。为了确定较佳的搅拌速率,本文考察了搅拌速率分别为200、250、300和350r/min时,对胞外COD合成的影响,结果如图3所示。

图3 搅拌速率对产酶的影响Fig.3 The effect of stirring rate on enzyme activity of COD in the broth

由图3可见,当搅拌速率分别为200、250、300和350r/min时,胞外COD酶活的最大值分别出现在发酵的第40、40、40和36h,且酶活分别为1.13、1.19、1.18和1.09U/mL。较高的搅拌速率下,胞外COD的最大值反而较小,原因可能是由于转速过高产生了大量泡沫,造成发酵液逃逸,使培养液中COD诱导物胆固醇大量聚集,不能很好的分散到发酵液中,进而影响胞外COD的合成。因此,确定较佳搅拌速率为250r/min。

2.4 DO对COD产生的影响

对于好氧微生物来说,发酵液中DO浓度对微生物生长和产物形成有着重要影响。本文考察了不同DO浓度对SG03产胞外COD的影响,实验通过改变通气速率控制培养液的DO,实验选取DO控制在20%、40%、60%、80%和90%五个不同水平。

不同DO浓度对SG03产胞外COD的影响如图4所示。当DO分别控制在20%、40%、60%、80%和90%的空气饱和度时,最高酶活分别为0.91、0.93、0.96、1.06和1.04U/mL。随着DO浓度的增加,胞外COD酶活最大值出现的时间逐渐提前,分别为发酵的第52、52、48、40和36h。当DO为90%时,COD酶活在第36h已达最大值,比DO浓度控制在20%和40%时,胞外COD酶活最大值出现的时间整整提前了16h；但随后酶活开始下降,原因可能是过高的DO导致菌体死亡速度加剧和酶活快速衰减。由以上DO实验结果可以看出,在SG03发酵过程中,发酵前期较高的DO浓度较有利于胞外COD的积累,发酵后期较低的DO浓度较有利于胞外COD的积累；同时,DO对SG03产胞外COD的影响较培养液起始pH、搅拌速率等因素的影响要大,因此,为了获得更高的COD产量,提出在发酵过程中实施两阶段DO控制策略。

图4 DO对产酶的影响Fig.4 The effect of DO on enzyme activity of COD in the broth

2.5两阶段DO控制对COD产生的影响

由表1可知,在单一DO控制实验中,随着DO从90%降到20%,菌体最大生物量和细胞平均生长速率相应下降,这表明在DO 20%时,部分细胞呼吸代谢受到了限制。但是,与DO90%相比,DO为80%时,COD产量最高。这表明在产物合成期,并非溶解氧越大越有利于COD合成。因此,我们推断COD的产生可能与菌体生长对氧的要求不一样。另外,我们从图4还可以看出,虽然当DO控制在较低浓度20%和40%时,COD的最大产量均低于最高的DO80%。但在发酵的第40h后,仍然有较强的COD合成能力,COD酶活增加趋势一直维持到发酵的第52h,即菌体在发酵后期具有较大的COD比生产速率(ρ值)；此时,较高溶解氧浓度80%和90%条件下的COD比生产速率已呈明显下降趋势。

表1 DO对SG03产生COD的影响Table1 Effects of various DO control on the COD production in submerged fermentation of SG03 in 10L bioreactor

注:最大生物量和最大COD产量一栏中括号中的时间表示该数值出现的时间。

由图4可以看出,在单一DO控制实验中,培养前期,DO浓度控制在90%时,COD比生产速率ρ值高于其它DO浓度；培养后期,DO控制在20%时,ρ值高于其它DO浓度。因此,为了在整个发酵过程中都能获得较高的ρ值,提出两阶段DO控制策略:发酵前期(前20h)DO控制在90%,当ρ值下降时,DO控制转至20%,直到发酵结束。

图5显示了在10L发酵罐中实施两阶段DO控制策略时,SG03发酵动态变化过程。发酵前期,ρ值在培养的第20h达到一个较大值,随后ρ值开始出现下降,此时将DO从90%变为20%。通过实施两阶段DO控制策略,胞外COD产量最大值和生产率分别达到了1.38U/mL和0.03U/(mL·h),较单阶段DO控制时获得的最高胞外COD产量和生产率分别增加了30.2%和20.0%。

图5 10L发酵罐中两阶段DO控制时 SG03发酵动态变化过程Fig. 5 Time profiles of cell growth,ρ and COD production in submerged fermentation of SG03 with two-stage DO control in 10L fermentor

3 结论

目前,COD在美国、日本等发达国家已经进入商品化生产,主要以发酵法进行生产。该酶及其氧化产物在临床诊断、制药、食品和农业等领域被广泛应用,商业价值巨大。我们国家对COD的使用主要依赖于进口,因此加强对COD的理论和应用研究,具有重要的现实意义。

本文在10L发酵罐中,研究了不同发酵条件对BacilluscereusSG03菌株产胞外COD的影响。在发酵过程中,菌体生物量和胞外COD的总体变化趋势一致,均呈现先增加后减小的趋势。发酵液起始pH为6.8时,最有利于胞外COD的积累,其最大值为1.14U/mL,表明该菌株在中性偏酸的环境下更有利于胞外COD的合成。搅拌速率为250r/min时,更有利于胞外COD的生成。

本实验中,DO对SG03菌株合成胞外COD具有重要影响,在单一DO控制实验结果的基础上,提出了两阶段DO控制策略,显著提高了胞外COD产量和生产效率,最大COD产量和COD生产率分别达到了1.38U/mL和0.03U/mL·h。在其它微生物发酵研究中,也有报道DO两阶段控制措施的有效性,但具体措施有所不同。在Aspergillusflavus发酵生产Kojic acid中,Ariff等基于氧限制有利于Kojic acid生产率的提高,提出了两阶段DO控制提高Kojic acid产量的策略[14]。在Torulopsisglabratausting发酵生产丙酮酸中,Li等通过采用两阶段氧供应(改变搅拌速度),显著提高了丙酮酸的生产率[15]。

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Fermentation conditions optimization of cholesterol oxidase in the broth byBacilluscereusSG03 in a 10L fermentor

GEFei1,GONGQian1,ZHANGHui-min1,HUANGYin1,SHIBei-jie1,GUILin2,*

(1.Department of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China;2.Department of Microbiology and Immunology,Wannan Medical College,Wuhu 241000,China)

Objective:The technique of producing cholesterol oxidase by the strain ofBacilluscereusSG03 in a 10L fermenter was optimized,in order to provide the basis for further application of the strain. Methods:The effect of pH of the culture medium,stirring rate and DO on the production of cholesterol oxidase in the broth byBacilluscereusSG03 was studied in a 10L fermentor. Results:The optimum fermentation conditions were initial pH at 6.8,stirring rate at 250r/min and DO at 80%. Based on the results,a strategy of two stage DO manipulation was proposed,controlling DO at 90% before the 20h and at 20% from the 20h to at the end during the fermentation. The maximum COD activity in the broth and production efficiency reached 1.38U/mL and 0.03U/(mL·h),respectively improved 30.2% and 20.0% higher than with one stage manipulation.

Bacilluscereus;cholesterol oxidase;fermentor；two stage DO manipulation

2014-02-10 *通讯联系人

葛飞(1978-)，男，副教授，主要从事微生物资源开发与利用研究。

安徽省高等学校优秀青年人才基金项目(2011SQRL079)；安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目(KJ2013A049)。

TS201.3

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001