腊八豆低温后发酵过程中的挥发性成分变化研究

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(1.湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南长沙 410128；3.湖南省发酵食品工程技术研究中心,湖南长沙 410128)

腊八豆低温后发酵过程中的挥发性成分变化研究

欧阳晶1,2,杨俊换1,苏悟1,2,蒋立文2,3,*

(1.湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南长沙 410128；3.湖南省发酵食品工程技术研究中心,湖南长沙 410128)

以黄豆为原料、纯种毛霉发酵腊八豆后发酵过程为研究对象,利用固相微萃取法和气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)对低温后发酵不同时段的腊八豆中挥发性成分进行了测定。共鉴定出包括烷烃类(2)、烯烃类(29)、杂环类(6)、醇类(10)、醛类(1)、酮类(1)、酸类(2)、酯类(7)、醚类(3)等9类62种化合物。结果表明,随着发酵的进行,杂环类、醛类、酮类等风味化合物有所增加,醇类与酸类化合物的减少伴随着酯类的增加,1-辛烯-3-醇等不良风味逐渐减少,低温发酵有利于减少褐变,促进风味物质的形成。

腊八豆,低温发酵,挥发性成分,固相微萃取法与气相色谱-质谱联用

腊八豆是我国南方传统发酵食品之一,现代工艺以新鲜的黄豆为原料,经过蒸煮,接种纯种毛霉、密封厌氧发酵制作而成,使得其具有风味独特、营养丰富等特点[1]。随着对传统发酵食品微生物发酵剂、生产工艺、安全控制等方面的深入研究,腊八豆风味的产生与调控慢慢地引起关注。对一种产品而言,风味成分是反映其质量品质的重要指标。而风味化合物除少部分天然存在于动植物原料外,大部分则在加工过程中经不同代谢途径而产生[2]。就发酵豆制品而言,其风味成分主要来源于发酵阶段原料中的脂肪、淀粉、蛋白质经微生物酶水解后产生的各类次级产物与小分子风味成分,这使得不同发酵阶段的挥发性风味物质的含量与组成各不相同[3]。因此,分析测定不同发酵时间腊八豆的挥发性成分,将为腊八豆的生产工艺和风味的调控提供有价值的信息。

工业化生产发酵豆常采用恒温后发酵技术,这种后发酵方式能大幅度提高蛋白的转化率,缩短生产周期。但因后发酵时间较短,风味成分难以凝集,造成风味缺失的现象[4]。低温后发酵不仅能保证后发酵时间,使得体系中的酶系与风味物质得到最充分的作用与结合,并且防止褐变与抑制杂菌的作用[5]。

固相微萃取法和气相色谱-质谱联用技术(Solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)是一种利用萃取头表面的色谱固相相对分析组分的吸附作用对组分进行提取与富集,再以高温解吸附结合气相色谱-质谱联用技术进行分析鉴定的过程[6]。这种方法摒弃了液液萃取、索氏萃取等传统方法的大量使用有机溶剂、填充料,处理时间长、操作步骤繁琐等缺点,广泛地应用于食品挥发性成分的测定中[7-8]。现今利用SPME-GC-MS技术已经对曲霉型、细菌型等发酵豆豉挥发性成分进行了进行了鉴定,探索出诸如吡嗪类、醇类、酚类等特征风味物质,却未见对于腊八豆挥发性成分探索的先例[9-10]。本研究选取后发酵30、60、90d的毛霉纯种低温发酵腊八豆作为对象,利用固相微萃取技术(SPME)提取样品中的挥发性成分,结合气相色谱-质谱联用技术(GC-MS),对照计算机谱库(Nist 2002)鉴定低温后发酵不同阶段的腊八豆中挥发性成分,以期为腊八豆品质调控提供理论依据。

表1 不同发酵时间腊八豆挥发性成分Table 1 Volatile compounds of fermented soybean in different fermentation time

续表

1 材料与方法

1.1材料与仪器

黄豆 购买于湖南农业大学东之源超市；M263毛霉 由湖南农业大学微生物教研室提供。

GL-3250磁力搅拌器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；固相微萃取(SPME)装置 美国Supelco公司；GC/MS-QP2010气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司。

1.2实验方法

1.2.1 腊八豆的制备 市售的黄豆去杂、去瘪豆,用清水洗净,然后在室温的条件下浸泡3～6h；将水分滤去,常压蒸煮30min后放置在无菌的环境中自然冷却至室温,将制备好的纯种毛霉菌种接种至熟豆中,20～25℃制曲,经48～72h成熟后拌入适量的盐、酒、姜、干辣椒粉于20℃的条件下进行恒温后发酵。

1.2.2 实验设计 利用SPME-GC-MS测定腊八豆低温后发酵30、60、90d的挥发性成分。

1.2.3 挥发性成分的萃取及分析

1.2.3.1 挥发成分萃取 萃取头的活化:为去除萃取头上的杂质,固相微萃取之前,必须对萃取头进行活化。将50/30μm(DVB/CAR/PDMS)萃取头在270℃的条件下老化1h,直至色谱检测无干扰峰出现。

固相微萃取(SPME):取若干腊八豆样品以1∶2的比例加入蒸馏水,搅打成泥状,取9g腊八豆泥,加入至20mL的顶空进样瓶中,用密封垫与铝帽进行密封,密封后在70℃的条件下利用磁力搅拌器加热平衡15min,将已活化的萃取头通过隔垫插入顶空进样品内,推出纤维头,使之距样品液面约5mm,顶空吸附40min,收回纤维头。

1.2.3.2 提取物分析 将萃取后的萃取头插入气相色谱进样口解析5min,利用GC/MS得到总离子流色谱图。

色谱条件:色谱柱:DB-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)；载气:He；流速:1mL/min；进样口温度:250℃；进样方式:不分流进样；程序升温:起始温度为60℃,保留1min,后以6℃/min升温至100℃,无保留,再以5℃/min升温至200℃,无保留。

质谱条件:离子源温度:200℃；电离方式:EI；电子能量:70eV；灯丝电流:150μA；扫描质量范围45～500m/z[11]。

采用计算机谱库(Nist 2002)检索分析与峰面积归一化法得到各挥发性成分名称及相对含量。

2 结果与分析

2.1低温发酵30、60、90d的腊八豆挥发性成分统计

低温发酵30、60、90d的腊八豆挥发性成分质谱图如图1、各挥发性成分名称与相对含量如表1。

从图中可知,谱图峰形对称,出峰匀称,峰重叠现象少,不同样品之间峰形具有明显区别,说明SPME-GC-MS条件适宜,能客观地反应不同后发酵时间腊八豆的挥发性成分变化。

续表

图1 发酵30 60、90d的腊八豆挥发性成分质谱图Fig.1 GC-MS chromatograms of volatile compounds of fermented soybean of 30d fermentation, 60d fermentation 90d fermentation

从腊八豆的发酵过程中共检出62种挥发性成分,其中烷烃类化合物2种、烯烃类化合物29种、杂环类化合物6种、醇类化合物10种、醛类化合物1种、酮类化合物1种、酸类化合物2种、酯类化合物7种、醚类化合物3种。

从发酵30d的腊八豆中共检出35种挥发性成分,其中酸类化合物2种(41.17%)；醇类化合物5种(40.97%)；烯烃类化合物19种(7.28%)；酯类化合物3种(4.18%)；杂环化合物2种(3.83%)；醛类化合物1种(1.05%)；醚类化合物2种(0.71%)；烷烃类化合物1种(0.08%)。主要香味成分包括1-丙基醋酸(41.11%)、3-甲基-2-环氧乙醇(32.25%)、桉油醇(3.84%)、1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯(3.78%)、1-辛烯-3-醇(3.71%)、大蒜素(2.92%)、乙烷基己酸酯(1.39%)、苯甲醛(1.05%)。这些香气成分占总峰面积的90.05%。

从发酵60d的腊八豆中共检出34种挥发性成分,其中酯类化合物5种(35.06%)；醇类化合物8种(30.64%)；烯烃类化合物13种(19.5%)；醚类化合物2种(5.61%)；杂环化合物2种(5.2%)；烷烃类化合物2种(2.48%)；醛类化合物1种(1.08%)；酮类化合物1种(0.44%)；酸类化合物1种(0.05%)；。主要香味成分包括乙酸乙酯(25.6%)、戊醇(15.06%)、桉树醇(6.0%)、乙酸异戊酯(5.79%)、二烯丙基二硫醚(5.3%)、1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯(5.1%)、2-羟基丙酸酯(3.16%)、大蒜素(2.92%)、乙醇(2.84%)、β-芳樟醇(2.18%)、1-辛烯-3-醇(2.09%)、4-萜烯醇(1.34%)、苯甲醛(1.08%)、4-松油醇(1.0%)。这些香气成分占总峰面积的79.46%。

从发酵90d的腊八豆中共检出35种挥发性成分,其中酯类化合物5种(65.07%)；醇类化合物5种(14.41%)；杂环化合物6种(8.38%)；烯烃类化合物14种(5.55%)；醚类化合物2种(4.35%)；醛类化合物1种(1.29%)；烷烃类化合物1种(0.17%)。主要香味成分包括乙酸乙酯(48.33%)、甲酸异戊酯(10.71%)、1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯(6.88%)、桉树醇(5.76%)、乙酸异戊酯(5.44%)、乙醇(4.66%)、二烯丙基二硫醚(3.13%)、1-辛烯-3-醇(1.50%)、β-芳樟醇(1.39%)、苯甲醛(1.29%)、4-烯丙基苯甲醚(1.22%)、4-萜烯醇(1.1%)、(R)-1-甲基-4-(1,2,2-三甲基环戊基)-苯(1.0%)。这些香气成分占总峰面积的92.41%。

2.2低温发酵30、60、90d腊八豆挥发性成分分析

腊八豆的挥发性成分不仅包括原料大豆所含有常见的醇类、醛类[12],同时也包含后发酵过程中加入的生姜所含有的莰烯、α-姜黄烯等[13]；八角茴香中所含有的草蒿脑、石竹烯等[14]；大蒜中所含有的二烯丙基二硫醚、大蒜素等[15]物质及酒中含有的乙醇、乙酸乙酯等化合物,并且因为微生物发酵分泌大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶酶系水解原料中的营养物质生成脂肪酸、短肽、氨基酸等进而生产大量相应杂环类、醛类、酮类等风味化合物,这些物质都在低温发酵腊八豆的挥发性成分中被检测出来。

发酵30d的腊八豆挥发性物质主要以酸类与醇类为主,醇类物质的产生可能是因为拌料过程中加入白酒及后发酵中酵母菌及乳酸菌等次生菌体代谢产生的,酸类的来源可能与大豆中油脂被微生物所产生的脂肪酶降解为低分子量脂肪酸,及有产酸微生物发酵所致[16]。醇是形成多种物质的前体物质,有机酸经酯酶催化生成酯类,具有芳香味。同时本身醇也可以使产品具备微甜醇厚的风味[4]是极为重要的风味物质与风味前提物质之一。体系中主要挥发性成分桉油醇具有有樟脑气息和清凉的草药味道,大蒜素具有大蒜味与冲鼻气味,乙烷基己酸酯具有酒香[17],这些都是腊八豆重要的风味构成成分。

发酵60d的腊八豆挥发性物质主要以醇类与酯类为主,烯烃烷烃类、杂环类物质从种类上有所减少,醇类与酯类在种类上均有一定的增加,从相对含量上,除酸类外,其他都有不同程度的增加。其中戊醇和乙酸乙酯同比发酵30d的产品挥发性成分有很大的增加,戊醇的增加可能依然与酵母菌与乳酸菌的代谢有关,其具有酒香风味；酯类的产生可能是醇与酸发生酯化反应的结果,呈现出微带果香的酒香。主要的挥发性物质中β-芳樟醇具有花香与木香、4-萜烯醇呈暖的胡椒香、较淡的泥土香和陈腐的木材气息,4-松油醇具似海桐花的清香,甜的紫丁香、铃兰气息[17],它们都是腊八豆风味的重要组成成分。

发酵90d后的腊八豆挥发性物质主要以酯类为主,呈酒香与花香味的乙酸乙酯占到总挥发性成分的48.33%,醇类与酸类物质相对含量有所减少,杂环类与醛类物质相对含量有所增加。此发酵过程中,酯化反应继续进行,这可能是酯类物质含量与种类都在不断增加而醇类与酸类物质相对含量有所减少的原因,发酵初期体系中香辛料所含的风味成分都有不同程度减少,而其他类物质有所增加可能与体系复杂的生化反应使得大分子物降解与风味物质的合成有关。

整个发酵过程中,一直含有的物质有(+)-环异蒜头烯、古巴烯、1-辛烯-3-醇、β-芳樟醇、苯甲醛等,除1-辛烯-3-醇外,其他均对腊八豆的风味具有一定的贡献。1-辛烯-3-醇呈豆腥味,随着发酵的进行其含量在不断减少。整个低温发酵过程中,未检测到挥发性酚与吡嗪物质的产生,这可能是低温发酵过程抑制酶促褐变的根源所在[18]。

3 结论

采用GC/MC技术测定不同发酵时间的腊八豆的挥发性成分,从腊八豆的发酵过程中共检出包括烷烃类、烯烃类、杂环类、醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、醚类共62种挥发性成分,诸如(+)-环异蒜头烯、古巴烯、β-芳樟醇、苯甲醛、茴香脑、松油醇等特征物质被检出,与黄红霞[19]等人的研究结果相似。

随着发酵的进行,腊八豆中的挥发性成分在相对含量上逐渐形成,杂环类,醛类、酮类等风味化合物无论从种类还是相对含量上均有所增加,醇类与酸类化合物的减少伴随着酯类的增加,1-辛烯-3-醇等不良风味逐渐减少,整个后发酵阶段为检测到挥发酚与吡嗪类物质。说明酶促褐变程度较低,保证了酶系的充分作用及风味物质的生成,保障了腊八

豆风味的形成。

但是每种挥发性香味成分的阈值相差很大,所以相对含量对风味的影响较大,本实验测定了各挥发性成分的相对含量,因为方法限制,无法得到各挥发性成分的香气活性值,因此无法确定各组分化合物对腊八豆风味的影响,这一点待进一步深入研究。

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Determination of changes of volatile substances of fermented soybean in process of Low-temperature post-fermentation

OuYang-jing1,2,YangJun-huan1,SuWu1,2,JiangLi-wen2,3,*

(1.Food Science and Technology College of Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China;3.Fermented Food engineering and technology Research Center of Hunan province,Changsha 410128,China)

Soybean was chosen as material of this research,and the process of post-fermentation of fermenting soybean with Mucor was chosen as the researching object. solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry(SPME-GC-MS)were used to determine the volatile substances of fermented soybean with low-temperature fermenting condition at different time.62 volatile compounds were identified,which could be classified as 9 categories including alkanes(2),olefins(29),aromatics(6),alcohols(10),aldehydes(1),ketones(1),acids(2),esters(7),ethers(3). The results indicated that during the fermentation,the flavor compounds such as aromatics,aldehydes and ketones were increased,the contents of alcohols and acids compounds were reduced while esters compounds were increased,the contents of bad flavor 1-octen-3-ol etc were reduced gradually.Fermentation in low temperature is beneficial to reduce the browning,promote the formation of flavor substances.

fermented soybean；low-temperature fermentation；volatile components；SPME-GC-MS

2013-12-16 *通讯联系人

欧阳晶(1989-)，男，在读研究生，研究方向：食品生物技术。

国家自然科学基金项目(31371828)。

TS264.2

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001