川佛手中总黄酮的超临界CO2萃取工艺优化

邓 祥，黄小梅，吴 狄

(1.四川文理学院化学化工学院，四川 达州 635000;

2.四川文理学院“特色植物开发研究”四川省高校重点实验室，四川 达州 635000)

川佛手中总黄酮的超临界CO2萃取工艺优化

邓 祥1，2，黄小梅1，2，吴 狄1，2

(1.四川文理学院化学化工学院，四川 达州 635000;

2.四川文理学院“特色植物开发研究”四川省高校重点实验室，四川 达州 635000)

采用超临界CO2萃取技术提取川佛手中的总黄酮，通过单因素分析和正交试验，确定了川佛手中总黄酮的最佳提取工艺参数，即萃取压力为30 MPa，萃取温度为50℃，料液比为100∶120 g/mL和萃取时间为2.0 h，在此条件下总黄酮的萃取率达到3.79﹪.

超临界CO2萃取;川佛手;总黄酮

佛手又名佛手柑、五指橘，为芸香科植物佛手(Citrusmedica L.var.sarcodactylis Swingle)的果实［1-2］.其味辛、苦、甘，性温，无毒;入脾、肝、胃三经，有理气化痰、止呕消胀、舒肝健脾、和胃止痛等多种功效.作为我国一种传统的中药材，佛手具有极高的药用价值，并可与多种中药材配伍使用，对咳嗽痰多、肝胃不和、肝郁气滞等疾病具有很好的疗效［3-4］.佛手在中国栽培历史悠久，主要种植于广东、四川、浙江和福建等地.此外，广西、安徽、云南等省区也有栽培.因产地不同，主要分为广佛手、川佛手、金佛手和建佛手等品种［5-6］.其主要有效化学成分有挥发油、黄酮、多酚和糖类等物质［7］.黄酮类物质是植物经光合作用产生的以黄酮(二苯基色原酮)为母核的一系列同类化合物［8］.研究表明，这类物质具有多种生物特性和生理活性，广泛应用于医药、食品、化妆品和保健品等领域［9-10］.当前，有关总黄酮的提取方法主要有酶解辅助法、大孔树脂吸附法、超滤法和微波提取法等［11-12］.这些方法一般能耗高、用时长和提取效率低等.超临界CO2萃取技术作为一种新型萃取技术，具有速度快、易分离、无毒害残留和对物质的结构无损伤等优点，特别适合易氧化和热敏性物质的萃取分离［13］.本文以川佛手为原料，通过超临界CO2萃取技术得到川佛手有效化学成分，利用紫外分光光度法实现对黄酮类化合物的检测，通过单因素分析和正交试验，对总黄酮的提取工艺进行研究，以期为川佛手的质量控制和总黄酮的提取等提供理论和技术依据.

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器设备

HA420-40-96型超临界二氧化碳萃取仪(南通华安);DFY-5型冷凝水循环系统(巩义予华);UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津);TG328A型电子天平(上海精密仪器有限公司);BZF-30真空干燥箱(上海博迅);RE-2000A型旋转蒸发仪(上海亚荣);60目筛子.

1.2 实验试剂

佛手(四川达州产);芦丁标准品(上海试剂);无水乙醇、硝酸铝、氢氧化钠和亚硝酸钠等均为分析纯;实验用水均为二次蒸馏水.

2 方法与实验

2.1 超临界 CO2萃取［14］

准确称取经60目过筛的川佛手粉末100 g装入料筒中，接着将料筒装入萃取釜，装好压环和密封圈，旋紧堵头，然后开启超临界CO2萃取仪，设定好仪器参数(压力、温度、CO2流量和萃取时间等)后，进行萃取，收集萃取液，将萃取液定容至500 mL，依据芦丁标准试剂结合紫外-可见分光光度计进行定性分析和定量测定.

2.2 总黄酮标准曲线的确定［15-17］

准确称取经干燥至恒重的芦丁标准品0.020 0 g，用适量乙醇完全溶解，定容至 100 mL，作为储备液.再从储备液中分别吸取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL于1～7号25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 5﹪(质量分数)亚硝酸钠溶液，混合均匀后静置5 min，加1.0 mL 10﹪(质量分数)硝酸铝溶液，静置5 min，再加入5.0 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，静置15 min，定容.以第1瓶作为空白参比，在芦丁标准品最大吸收波长510 nm处测定其吸光度，以浓度和吸光度分别为横纵坐标绘制标准曲线，如图1所示.

图1 芦丁标准曲线

2.3 样品总黄酮测定［18］

将经超临界CO2流体萃取的萃取液按2.2的方法处理后，测定其吸光度，从而得到总黄酮浓度，再按下式计算其萃取效率.

其中:C为萃取液中的总黄酮浓度(g·mL-1)，V为萃取液的体积(mL)，M为川佛手的质量(g).

2.4 单因素分析［19-20］

据文献报道，萃取温度、萃取压力、萃取时间、物料粒度、料液比、改性剂种类和浓度等因素对萃取率都会产生影响.本实验根据萃取物的自身特点，主要研究萃取压力、萃取温度、料液比(物料量与夹带剂之比)和萃取时间等因素对川佛手中总黄酮萃取率的影响.

2.5 正交试验设计

根据2.4中单因素分析结果，以总黄酮萃取率为指标，做四因素三水平即L9(34)正交试验，按表1进行正交试验设计.

表1 L9(34)正交试验因素水平表

3 结果与讨论

3.1 单因素分析

3.1.1 萃取压力对萃取率的影响

在萃取温度为50℃、CO2流量为35 kg/h、萃取时间为2 h的条件下，分别讨论在萃取压力为10、20、30、40、50 MPa 的情况下对总黄酮萃取率的影响，实验结果如图2所示.

图2 萃取压力对萃取率的影响

从图2可知，在一定压力范围内，总黄酮的萃取率随着压力的增大而增加，但当压力为30 MPa后，萃取率基本趋于稳定.这主要是因为压力小于20 MPa时，流体以亚临界状态存在，不利于黄酮的萃取，萃取率较低;当压力大于20 MPa后，流体以临界状态存在，随着压力的增大，超临界状态的CO2的密度增加，总黄酮在CO2中的溶解能力随之增强，有利于黄酮的萃取，萃取率增加;当压力过大超过30 MPa后，原料可能被压实甚至结块，不利于物质的萃取，因此没有得到更多的黄酮类物质.从综合萃取率及能耗等方面因素考虑，选择30 MPa作为后续实验的萃取压力，此时萃取率为2.86﹪.

3.1.2 萃取温度对萃取率的影响

在萃取压力为30 MPa、CO2流量为35 kg/h、萃取时间为2 h的条件下，分别讨论在萃取温度为 30、35、40、45、50 ℃的情况下对总黄酮萃取率的影响，实验结果如图3所示.

图3 萃取温度对萃取率的影响

从图3可知，在起初阶段，总黄酮的萃取率随着温度的升高而增加，当萃取温度达到45℃时，萃取率达到最大值，之后随着温度的升高萃取率呈现下降趋势.这主要是因为温度低于30℃时，流体以亚临界状态存在，不利于萃取，萃取率低;随着温度的升高，加剧了分子的热运动，有利于黄酮类物质的溶出，萃取率增大;同时随着温度的升高，CO2的密度降低，其溶解能力下降，致使萃取率呈现下降趋势;黄酮类物质属热敏性物质，温度过高，易分解，最终表现为萃取率降低.综合能耗及以上因素，选择萃取温度45℃作为参考温度，此时萃取率为3.12﹪.

3.1.3 料液比对萃取率的影响

在萃取压力为30 MPa、萃取温度为45℃、CO2流量为35 kg/h、萃取时间为2 h的条件下，分别讨论在料液比为 100∶60、100∶80、100∶100、100∶120、100∶140 g/mL 的情况下对总黄酮萃取率的影响，如图4所示.

图4 料液比对萃取率的影响

从图4中发现，在一定的料液比情况下，萃取率随着夹带剂的增加而增大，当料液比达到100∶100 g/mL时，萃取率基本稳定，没有明显的变化趋势.可能是夹带剂的用量增加，萃取出溶质的浓度较低，有利于黄酮类化合物的溶出;但夹带剂用量过大，萃取液的量增加，从而对后续操作不利.因此选择料液比100∶100 g/mL作为参考料液比，此时萃取率为3.32﹪.

3.1.4 萃取时间对萃取率的影响

在萃取温度为45℃、压力为30 MPa、CO2流量为35 kg/h的条件下，分别讨论在萃取时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 的情况下对总黄酮萃取率的影响，如图5所示.

图5 萃取时间对萃取率的影响

从图5可以看出，随着萃取时间的延长，黄酮类化合物的萃取率不断增大，但实验表明，萃取时间达到1.5 h后，即使时间继续延长，萃取率的增加值也变化微弱，因为此时黄酮类物质基本萃取完全.所以从节能方面考虑，选择1.5 h为参考萃取时间，此时萃取率为3.22﹪.

3.2 正交试验

根据单因素实验分析和正交水平表，对萃取压力(A)、萃取温度(B)、料液比(C)和萃取时间(D)4因素进行L9(34)正交试验，试验结果和极差分析见表2所示.

由表2可知，各因素对萃取率的影响程度大小顺序为:B＞A＞D＞C，超临界萃取的最佳提取工艺为:A2B3C3D3，即萃取压力为30 MPa，萃取温度为50℃，料液比为100∶120 g/mL和萃取时间为2.0 h.此条件下总黄酮的最大萃取率为3.62﹪.

表2 L9(34)正交实验结果

3.3 验证试验结果分析

根据正交试验优化结果，在最佳提取工艺条件下做平行实验，考察川佛手中黄酮萃取率的最优水平条件，如表3所示.

表3结果显示，在最佳萃取条件下采用3组平行试验进行验证，可得川佛手中总黄酮的萃取率为 3.79﹪，RSD 为 0.10﹪.

表3 最佳萃取条件下的验证试验结果

4 结论

超临界萃取法是中药材有效化学成分提取的发展方向，具有萃取效率高、分离效果好、物质结构和活性不受影响等优点，适用于易氧化和热敏性物质的提取.本文采用超临界CO2流体萃取技术，通过单因素分析和正交试验，得到了川佛手中总黄酮的最佳提取工艺参数，即萃取压力为30 MPa，萃取温度为50℃，料液比为100∶120 g/mL和萃取时间为2.0 h，总黄酮的萃取率达到3.79﹪.

［1］中华本草编委会.中华本草:精选本(上)［M］.上海:上海科技出版社，1998:10-20.

［2］张福平，连少虹，陈蔚辉.佛手柑黄酮类化合物提取工艺研究［J］.食品研究与开发，2005，26(3):99-101.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典(2005版第一部)［M］.北京:化学工业出版社，2005:124.

［4］姜立春，黄成思，杨澈，等.川佛手总黄酮提取及抗氧化性研究［J］.江苏农业科学，2010，12(3):340-342.

［5］中华本草编委会.中华本草:精选本(上)［M］.上海:上海科技出版社，1998:10-20.

［6］肖培根.新编中药志［M］.北京:化学工业出版社，2002:304.

［7］袁旭江，林励.中药佛手不同品种间的研究及其存在问题［J］.广州中医药大学学报，2002，19(1):73-76.

［8］杨洋，余炼.柚皮黄酮的提取工艺及其含量测定［J］.广西轻工业，2001，16(4):47-50.

［9］鲁晓翔，陈杰，唐津忠.四种茶花的抗氧化性研究［J］.食品研究与开发，2006，27(8):22-25.

［10］Mahal H S，Mukherjee T.Scavenging of reactive oxygen radicals by resveratrol:antioxidant effect［J］.Research on Chemical Intermediates，2006，32(1):59-71.

［11］于涛，钱和.膜分离技术在提取银杏叶黄酮类化合物中的应用［J］.无锡轻工大学学报，2004，23(6):55-59.

［12］黄剑波，孙哲浩，董华强.酶解辅助提取甜茶黄酮类化合物的研究［J］.食品研究与开发，2008，29(2):36-40.

［13］王正云.超临界CO2萃取芦笋中总黄酮的工艺研究［J］.食品研究与开发，2007，28(10):42-45.

［14］吕程丽，欧阳玉祝，梅杰，等.CO2超临界萃取葛根总黄酮的研究［J］.食品与发酵科技，2009，45(5):21-23.

［15］刘增根，党军，江磊，等.柴达木枸杞叶有效成分高压均质提取及纯化［J］.精细化工，2011，16(4):350-354.

［16］罗伟强.四种提取柑皮中黄酮化合物的方法比较［J］.甘肃化工，2003，8(1):25-26.

［17］李攀登，李金玲，王宏伟，等.鸡树条荚蒾化学成分测定分析［J］.人参研究，2009，6(2):16-19.

［18］唐楷，颜杰，黄新.金银花总黄酮的提取工艺优化及其抑菌作用研究［J］.中国食品添加剂，2012，4(2):154-157.

［19］Park H S，Choi H K，Lee S J，et al.Effect ofmass transfer on the removal of caffeine from green tea by supercritical carbon dioxide［J］.Journal of Supercritical Fluids，2007，42(2):205-211.

［20］Kim W J，Kim JD，Kim J，et al.Selective caffeine removal from green tea using supercritical carbon dioxide extraction［J］.Journal of Food Engineering，2008，89(3):303-309.

(责任编辑 穆 刚)

Process optim ization of total flavonoids from chuan bergamot by supercritical CO2extraction

DENG Xiang1，2，HUANG Xiaomei1，2，WU Di1，2

(1.Department of Chem istry and Chem ical Engineering，Sichuan University of Arts and Science，Dazhou Sichuan 635000，China;
2.Key Laboratory of the Research on Characteristic Plants of Universities in Sichuan Province，Sichuan University of Arts and Science，Dazhou Sichuan 635000，China)

The total flavonoids was extracted from Chuan Bergamot by supercritical CO2extraction.The optimal parameterswere determined as follows:extraction pressure was 30 MPa;extraction temperature was 50 ℃;solid-liquid ratio was 100∶120(g/mL)and extraction time was 2.0 h by single factor tests and orthogonal experiments.Under these conditions，the extraction yield of total flavonoids is 3.79﹪.

supercritical CO2extraction;Chuan Bergamot;total flavonoids

TQ028.8

A

1673-8004(2014)05-0094-05

2014-03-25

四川省教育厅重点资助项目(13ZA0101);达州市科技局重点资助项目(JCYJ1119).

邓祥(1974-)，男，四川达县人，副教授，硕士，主要从事天然产物化学方面的研究.