天然虾青素对大鼠MCAO模型的保护作用研究

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1.昆明医科大学第四附属医院康复医学科，云南 昆明 650021；2. 云南中医学院，云南 昆明 650500

天然虾青素对大鼠MCAO模型的保护作用研究

潘雷1周莹1刘路明1万庆家2孙承锋1尹勇1迟越2*

1.昆明医科大学第四附属医院康复医学科，云南 昆明 650021；2. 云南中医学院，云南 昆明 650500

目的: 探讨天然虾青素对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用及机制。方法: 采用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤(MCAO)模型，以神经学评分、脑梗塞体积、血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)为评价指标，考察天然虾青素的脑保护作用。结果: 天然虾青素能够明显改善模型动物的神经病学症状，缩小脑梗塞体积，升高血清SOD活性，降低血清MDA水平。结论: 天然虾青素在防治大鼠脑缺血/再灌注损伤方面具有明显作用，其作用与抗氧化损伤有关。

虾青素；脑缺血/再灌注；抗氧化

天然虾青素(astaxanthin)是广泛存在于人类日常食物中的一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，虽然其结构类似于β-胡萝卜素(β-carotene)和叶黄素(lutein),但纯品虾青素的抗氧化活性却是两者的5～15倍[1]。大量研究表明，天然来源的抗氧化剂如维生素E[2]、银杏提取物[3]、番茄红素[4]等对哺乳类动物中风模型具有显著的脑保护作用，临床研究显示[5]，男性吸烟者经常食用富含抗氧化活性的食物可降低脑梗塞的风险，结合这些报道提示，具有抗氧化活性的成分或许能够减轻缺血所导致的脑神经损伤。为探讨天然来源的虾青素是否也具有对抗脑缺血/再灌注损伤的作用，故进行本文的研究，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物与试剂 虾青素，云南白鸥制药有限公司提供，批号：20140321，纯度90%；依达拉奉购自Adamas Reagent Co.,Ltd.； 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)购自美国Sigma公司；SOD试剂盒和MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；水合氯醛:分析纯，购自天津市科密欧化学试剂开发中心。

1.1.2 实验动物 清洁级SD大鼠，雄性，体重250～300g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：SCXK(川)2008-24。

1.1.3 主要仪器 酶标仪(infinite M200 PRO)；台式低速离心机(上海电机厂)

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药 SD大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、阳性对照组(依达拉奉：10mg/kg，ip.)、虾青素高剂量药组(10mg/kg，花生油配制，ig.)和虾青素低剂量药组(5mg/kg，花生油配制，ig.)，每组8只。假手术组分离大鼠左侧颈总动脉及颈内外动脉，但不插鱼线，灌胃给予花生油；模型组，复制MCAO模型，灌胃给予给予花生油；阳性对照组、虾青素高、低剂量药组，预防性连续给药7d，末次给药1h复制MCAO模型，每组动物手术缺血2h，再灌注24h，进行各指标的检测。

1.2.2 大鼠MCAO模型复制 参照Longa[6]等报道的方法，稍加改进，采用线栓法复制短暂性大鼠脑中动脉闭塞(MCAO)模型。

1.2.3 观察指标

1.2.3.1 神经学评分 复制MCAO模型后，采用改良的Bederson法[7](见表1)进行神经功能缺损评分。

表1 改良Bederson法评分标准

1.2.3.2 TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)染色及脑梗死体积的测定 缺血2h再灌注24h时，各组大鼠用10% 水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉后，腹主动脉取血，常规方法分离血清备用，断头取脑，沿脑桥上界面切断，去除嗅球，称全脑重，立即放入-20℃冰箱，20min 后取出。由前向后做连续冠状切片，共5片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点；第二刀在视交叉处；第三刀在漏斗柄处；第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。将脑切片置入0.1% TTC溶液中，后放入恒温振荡器中，37℃避光染色30min。将脑切片取出后放入4% 中性多聚甲醛中固定24h，取出脑片，用数码相机拍照，用Motic Images Plus 2.0 显微图象分析系统计算梗塞面积(粉红色为未受损的正常组织，而梗塞区则因线粒体损害不染色，呈白色)，由于水肿对其梗塞体积有影响，故采用公式对其修正。具体公式如下：

脑梗塞灶体积(mm3)=总梗塞面积×脑片厚度(2mm)

水肿修正后的脑梗塞灶体积(mm3)=梗塞体积×对侧半球体积/同侧半球体积

梗塞率(%)=水肿修正后的脑梗塞灶体积/双侧大脑半球体积×100%

1.2.3.3 血清SOD和MDA含量测定 严格按试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计方法 计量资料采用单因素方差分析法处理数据，方差齐者采用LSD法检验，方差不齐者采用Tamhane′s法检验。

2 结果与讨论

2.1 结果

2.1.1 天然虾青素对大鼠MCAO模型神经病学症状的影响 结果显示，天然虾青素高、低剂量均能改善大鼠MCAO模型的神经病学症状，详见表2。

表2 天然虾青素对大鼠MCAO模型神经病学症状的影响(n=8)

注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较,**P<0.01，*P<0.05。

2.1.2 天然虾青素对大鼠MCAO模型脑梗塞体积的影响 结果显示，天然虾青素高、低剂量能显著减少大鼠MCAO模型脑梗塞体积。详见表3、图1。

表3 天然虾青素对大鼠MCAO模型脑梗塞体积的影响(n=8)

注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较,**P<0.01，*P<0.05。

注：a：假手术组， b：模型组，c：依达拉奉，d：虾青素高剂量，e：虾青素低剂量

图1各组对大鼠脑缺血/再灌注损伤的预防作用

2.1.3 天然虾青素对大鼠MCAO模型血清SOD和MDA含量的影响 结果显示，天然虾青素可提高大鼠MCAO模型血清SOD含量，降低MDA含量，详见表4。

表4 天然虾青素对大鼠MCAO模型血清SOD和MDA含量的影响(n=8)

注：与假手术组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05。

2.2 讨论

根据国家卫生部公布的第三次全国慢性非传染性疾病死因调查结果显示，脑血管疾病已占死亡总数的22.45%，目前中国每年脑卒中新发病例有250万，而死于脑卒中的约有150万人，脑血管疾病已成为严重危害人类健康的疾病之一。在脑血管疾病中，缺血性脑血管病是其主要的组成部分，目前临床治疗缺血性人脑血管病主要采用溶栓药物，但该治疗方案时间窗较窄，若超过时间窗应用溶栓药物可带来再灌注损伤的风险，因此寻找更加安全有效的抗脑缺血损伤药物是当前脑血管疾病研究的重点之一。有证据表明，氧自由基增加是脑缺血/再灌注损伤的一个重要因素，自由基的链锁反应是脑组织缺血/再灌注损伤的核心病理环节，脑是含磷脂极丰富的器官，在自由基脂质过氧化反应中可产生大量脂质过氧化产物丙二醛(MDA)，间接反应了体内氧自由基的代谢情况，而超氧化物歧化酶(SOD)可催化1分子O2氧化生成O2，另一分子O2还原生成H2O2，后者通过过氧化酶作用还原成水，从而减少脑组织中氧自由基的含量，对抗脂质过氧化反应对组织的破坏，因此，具有抗氧化损伤活性的成分可能具有潜在的脑保护作用。本实验的研究表明，天然虾青素对大鼠MCAO模型的脑损伤具有显著的保护作用，可以缩小脑梗塞体积，改善神经病学评分，并且可明显提高模型动物血清中SOD活性,减少血清中MDA的含量，提示，天然虾青素的抗氧化作用可能是其抗脑缺血/再灌注损伤的机制之一。

[1] Naguib Y M.Antioxidant activities of astaxanthin and related carotenoids[J].J Agric Food Chem,2000,8:1150-1154.

[2] Khanna S, Roy S,Slivka A,et al.Neuroprotective properties of the natural vitamin E alpha-tocotrienol[J].Stroke,2005,36:2258-2264.

[3] Zhang W R, Hayashi T, Kitagawa H, et al. Protective effect of ginkgo extract on rat brain with transient middle cerebral artery occlusion[J].Neurol Res,2000,22:517-521.

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Protectiveeffectofnaturalastaxanthinonratcerebralischemia/reperfusioninjury

PAN Lei1,ZHOU Ying1,LIU Lu-ming1,WAN Qing-jia2,SUN Cheng-feng1,YIN Yong1,CHI Yue2*

1.Department of Physical Medicine and Rehabilitation,the Fourth Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650021，China; 2.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China

ObjectiveTo observe the effect of the natural astaxanthin on the rat model of cerebral ischemia/reperfusion injury and detect the mechanism of it.MethodsThe middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was used. The neurological score, infarct volume, the content of SOD and MDA in the serum were evaluated.ResultsThe results showed that the natural astaxanthin could significantly improve the neurological symptoms, reduce the infarct volume, increase the activity of SOD and decrease the content of MDA in serum.ConclusionThe natural astaxanthin had a significant protective effect on rat cerebral ischemia/reperfusion injury. The mechanism may be related to antioxidant.

Astaxanthin;Cerebral ischemia/reperfusion injury;Antioxidant activity

云南省科技计划项目(2010CD186)；云南省教育厅科学研究基金项目(2010C083)。

迟越,E-mail:1735871@qq.com

R965.1

A

1007-8517(2014)23-0009-03

2014.10.20)