光谱法研究山柰酚与牛血清白蛋白的相互作用

裘兰兰,李悦,林锐,何华,3Δ,朱鸣阳

(1.盐城卫生职业技术学院 盐城,224005;2.中国药科大学 分析化学教研室,南京 210009;3.中国药科大学 天然药物国家重点实验室,南京 210009)

光谱法研究山柰酚与牛血清白蛋白的相互作用

裘兰兰1,李悦2,林锐1,何华2,3Δ,朱鸣阳2

(1.盐城卫生职业技术学院 盐城,224005;2.中国药科大学 分析化学教研室,南京 210009;3.中国药科大学 天然药物国家重点实验室,南京 210009)

目的 利用荧光光谱研究了山柰酚与BSA之间的相互作用。方法 利用Stern-Volmer方程，计算山柰酚分子与牛血清白蛋白的出双分子碰撞猝灭常数Kq和静态猝灭结合常数Ka。结果 双分子碰撞猝灭常数Kq分别为15.20×1012L/（mol·s)（298 K)，13.41 ×1012L/（mol·s)（310 K)，10.70 ×1012L/（mol·s)（318 K)，静态猝灭结合常数 Ka分别为 3.491 ×105L/mol（298 K)，8.183×105L/mol（310 K)，11.35×105L/mol（318 K)，并能形成一个结合位点。结论 中药小分子山柰酚分子确实与牛血清白蛋白结合，且通过静态猝灭的方式对BSA的内源荧光进行猝灭。

光谱法；山柰酚；牛血清白蛋白；相互作用

山柰酚(kaempferol),化学名为3,4',5,7-四羟基黄酮,来源于姜科植物山柰、小檗科植物窝儿七等多种植物的根茎、全草及干燥成熟果实中(见图1)［1-2］。近年来,山柰酚因其显著的药理作用及良好的生物利用度了广大医药工作者的关注,在临床上表现为具有抗菌、止咳、支气管炎、糖尿病、白内障、抗癌、抗癫痫、抗氧化剂、解痉、抗溃疡、利胆利尿等［3-5］。探索山柰酚入药后在人体内的药物代谢动力学过程极其关键,特别是对山奈酚与人体内蛋白质的作用模式的研究,更具有实际意义。本实验室之前也报道了一些关于中药小分子与蛋白质之间进行结合的研究［6-10］。本文在前期工作的基础上,使用荧光光谱法研究了山柰酚与牛血清蛋白的作用模式,作用机制以及山奈酚在牛血清白蛋白上的作用位置。

图1 山柰酚的分子结构式Fig.1 Chemical structure of kaempferol

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 日本岛津RF-5301 PC荧光分光光度计;离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(兰州物理化学研究所);三羟甲基氨基甲烷(Tris,上海精细化工试剂有限公司);山柰酚(南京泽朗生物科技有限公司);牛血清白蛋白(BSA,Amresco公司);其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法 山柰酚用离子液体溶液配制成4.6×10-4mol/L储备液备用。牛血清白蛋白用Tris-HCl缓冲液(pH 7.4,其中含0.1mol/LNaCl))制成5.0μmol/L标准溶液于冰箱中4℃保存备用。准确移取3mL牛血清白蛋白标准溶液置于比色皿中,以山奈酚溶液作为滴定剂,使用微量注射器逐次加入,具体加样体积由实验时浓度进行计算得到(滴定剂累加体积小于100μL)。分别在25℃、37℃和45℃下,在激发波长为278 nm,分别扫描298,310和318 K下290～500 nm波长范围的荧光光谱。

2 结果

2.1 山柰酚对BSA的荧光猝灭光谱 蛋白质的结构中含有色氨酸和酪氨酸基团,而这些基团是蛋白质产生荧光的内在来源。 在 BSA中依次加入0、1.5、3.0、4.5、6.0、8.5、11.0 μmol/L山柰酚后进行扫描所得的荧光图谱见图2。随着山柰酚浓度的增加,BSA的荧光强度有规律的降低,最大发射波长出现了明显蓝移现象。这表明山柰酚使BSA的荧光发生猝灭的现象。

图2 山柰酚对BSA的荧光猝灭图谱Fig.2 Fluorescence spectra of BSA in the presence of varying concentrations of kaempferolc(BSA)=5.0μmol/L,λex=280 nm,pH 7.40,T=298 K

2.2 山柰酚对BSA的荧光猝灭方式 荧光猝灭有2种形式,分别是动态猝灭和静态猝灭。当温度升高时,有效碰撞的离子数目增加,电子的转移变快,荧光物质的猝灭常数增加,这种形式称为动态猝灭;反之,当温度升高时,复合物的稳定性减弱,猝灭常数减小,这种形式称为静态猝灭［11］。

动态猝灭的过程遵循Stem-Volmer方程,方程式如下:

式中F0和F分别为加入猝灭物质前和加入猝灭分子后荧光分子的强度,Kq为双分子猝灭过程的速率常数,τ0为不存在猝灭物质时荧光分子的平均寿命;［Q］为猝灭物质浓度,Ksv为Stem-Volmer猝灭常数［12］。

本实验采用荧光光谱法研究了不同温度(298,310和318 K)下的山柰酚与牛血清白蛋白相互作用,根据实验数据,以BSA的F0/F为纵坐标,山柰酚浓度c为横坐标作图(见图3)。

图3 不同温度下山柰酚-BSA相互作用的Stern-Volmer曲线Fig.3 Stern-Volmer plot for the anction of BSA and kaempferolpH 7.40, λex=280 nm and λem=349 nm.

由图3可见,在不同温度下,所得的Stern-Volmer曲线具有良好的线性关系,且曲线的斜率的温度降低而升高。根据数据计算出Kq值(见表1),数量级都大于1012。而猝灭剂对蛋白质的动态猝灭常熟最大为2.0×1010L/(mol·s)。实验的数据远大于此值,且速率常数随温度降低而升高,这2者都说明药物与牛血清白蛋白确实发生了作用,而且应该为静态猝灭,主要原因是形成了复合物。

表1 不同温度下山柰酚-BSA的猝灭常数Tab.1 Stern-Volmer quenching constant of the systems of Kaempferol-BSA at different temperatur

2.3 结合常数KA与结合位点数n 山奈酚与蛋白质之间为静态猝灭,静态猝灭公式［13-14］如下:

对实验数据进行处理,以lg(F0-F)/F为纵坐标,lg［Q］为横坐标作图,得到一条直线,如图4。

图4 不同温度下山柰酚-BSA复合物的lg［(F0-F)/F］对lg［Q］图Fig.4 The plots of lg［(F0-F)/F］vs lg［Q］ at 298,310 and 318K

由直线方程式可求出山柰酚与牛血清白蛋白的结合常数KA及结合位点数n(见表2)。由表2数据可以看出,山柰酚与BSA的KA值均达到105,结合位点数n等于1,说明2者的相互作用挺强。还能观察到当温度升高时,结合常数由3升高到11,这说明温度对山奈酚与蛋白质之间的结合能力的影响较大。

表2 山柰酚与BSA的结合常数KA及结合位点数nTab.2 The binding constant(Ka)and the number of binding sites(n)

2.4 作用力类型的确定 药物与蛋白质之间的作用力包括范德华力、静电引力、疏水力等等。可以根据反应前后热力学焓变ΔH和熵变ΔS的大小,判断药物与蛋白质之间的主要作用力［14］。

由式3,4可求得298 K下山奈酚与BSA反应的热力学参数,见表3。

表3 山柰酚与BSA相互作用的热力学参数Tab.3 Thermodynamic parameters for the association of kaempferolwith BSA

由表3可见:ΔH＞0,ΔS＞0,说明2者之间以疏水作用为主;ΔG＜0,表明2者结合反应是由焓、熵驱动的自发过程。

3 讨论

山柰酚浓度的增加,蛋白质的荧光强度有规律的降低,2者之间存在相互作用,山柰酚与BSA之间形成了复合物,发生了能量转移。猝灭常数随着温度升高而降低,说明山柰酚与BSA之间的猝灭机制为静态猝灭。实验数据计算出310K时结合常数为8.183×105,表明山柰酚与BSA之间的自发结合能力较强,形成一个结合位点,山柰酚与BSA之间的作用力类型以疏水作用力为主,且为自发过程。

［1］ Hernández I， Alegre L， Van Breusegem F， etal.How relevant are flavonoids as antioxidants in plants? ［J］.Trends Plant Sci.， 2009，14（3):125-132.

［2］ Xu W，LU J， LI C， et al.Efficient second-harmonic generation in nonlinear plasmonic waveguide［J］.Cancer Lett.， 2008，264（2):229-240.

［3］ Labbe D，Provencal M， Lamy S.et al.The Flavonols Quercetin，Kaempferol，and Myricetin Inhibit Hepatocyte Growth Factor-Induced Medulloblastoma Cell Migration［J］.J.Nutr.， 2009， 139 （4):646-652.

［4］ Bandyopadhyay S，Romero JR，Chattopadhyay N.K aem pferol and quercetin stiu lategranulocyte-m acrophage colom ny-stiu lating factor ecretion in hum an p rostate can cer cells［J］.Mol.CellEndocrinol，2008， 287（1/2):57-64.

［5］ Sharma V，Joseph C， Ghosh S， et al.Kaempferol induces apoptosis in glioblastoma cells through oxidative stress［J］.Mol.Cancer Ther.，2007，6（9):2544-2553.

［6］ 查隽，何华，刘铁兵，等.荧光光谱法研究共存碳纳米管对牛血清白蛋白与加替沙星相互作用的影响［J］.光谱学与光谱分析，2011，31（1):149-153.

［7］ 张怀敬，何华，李杉杉，等.不同代PAMAM树状大分子与牛血清白蛋白的相互作用研究［J］.化学学报，2010，68（17):1741-1748.

［8］ 李杉杉，何华，陈哲，等.荧光光谱法研究碳纳米管与牛血清白蛋白间相互作用［J］.光谱学与光谱分析，2010，30（10):2689-2692.

［9］ 何华，李杉杉，芦金荣，等.荧光光谱法研究G3.0PAMAM树状大分子与牛血清白蛋白的相互作用［J］.光谱学与光谱分析，2009，29（10):2782-2786.

［10］ 李悦，谷雨，何佳，等.光谱法与分子模拟技术研究杨梅素与牛血清白蛋白的相互作用［J］.化学学报，2012，70（2):143-150.

［11］ Ware WR，JPhys Chem，1962，66:455-458.

［12］ Lakowicz JR，Weber G， Biochem，1973，12:4161-4170.

［13］ Yamamoto T， Moriwaki Y， Suda M， et al.Purification and immunohistochemical tissue localization of human xanthine oxidase［J］.Biochem Pharm，1993，46（12):2277-2284.

［14］ Krenitsky TA.，HallWW， de Miranda P， et al.Proc Natl Acad Sci，1984， 81（10)3209-3213.

(编校:吴茜)

Study on the interactions between kaem p ferol and bovine serum album in by spectroscopy and molecular docking method

QIU Lan-lan1,LIYue2,LIN Rui1,HE Hua2,3Δ,ZHU Ming-yang2

(1.Yancheng Health Vocational and Technical College,Yancheng 224005,China;2.Division of Analytical Chemistry,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China;3.Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

Objective The interaction of kaempferol with bovine serum albumin(BSA)was studied by fluorescence spectra.The quenching constants Kq at different temperatures were determined using Stern-Volmer equation.The Kq were 15.20×1012L/(mol·s)(298K),13.41×1012L/(mol·s)(310K),10.70×1012L/(mol·s)(318K).The binding constants(Ka)were 3.491×105L/mol(298 K),8.183×105L/mol(310 K),11.35×105L/mol(318 K).It shows kaempferol combinates the Trp212 of BSA,and the coaction of non-raditive energy transfer and static quenching quenches the intrinsic fluorescence of BSA.

spectroscopy;kaempferol;BSA;interaction

R631

A

1005-1678（2014)06-0175-03

国家基础科学人才培养基金(J0630858)；盐城卫生职业技术学院青年基金(20114105)

裘兰兰，女，硕士，讲师，研究方向：现代仪器分析技术，E-mail：qiu-0520@163.com；何华，通信作者， E-mail：dochehua@163.com。