川芎嗪对激素性股骨头缺血坏死模型兔血管新生因子的影响及促成骨作用的研究

李宝林,胡勇

(海南省农垦那大医院 骨科,海南 儋州 571700)

川芎嗪对激素性股骨头缺血坏死模型兔血管新生因子的影响及促成骨作用的研究

李宝林,胡勇

(海南省农垦那大医院 骨科,海南 儋州 571700)

目的 探讨川芎嗪对激素性股骨头缺血坏死模型兔血管新生因子的影响及其促成骨作用。方法 选取28只健康新西兰大白兔，雌雄各半，体质量（2.5±0.6)kg，随机分成A、B 2组。A组10只，每周肌注2次生理盐水，为对照组；B组18只，每周肌注2次8mg/kg地塞米松磷酸钠造模，为模型组。连续处理4周后，随机选取对照组和模型组各2只大白兔，行影像检查并做病理组织切片。证实造模成功后，将B组随机分成模型组和治疗组，每组8只。治疗组給予耳缘静脉注射14mg/kg盐酸川芎嗪注射液，模型组给予1.5mL生理盐水。实验8周后处死动物，采用Western blot法检测旋股内侧动脉和股静脉血管VEGF的表达，数字减影血管造影法检测股骨头血管数目及高倍显微镜下计算空骨陷窝比列。结果 治疗组旋股动脉和股静脉血管VEGF表达量较模型组高，差异有统计学意义（P＜0.01)；治疗组股骨头血管数目较模型组多，差异有统计学意义（P＜0.01)；空骨陷窝比例，治疗组较模型组低，差异有统计学意义（P＜0.01)。结论 川芎嗪能上调激素性股骨头坏死模型兔的血管新生因子表达，且对股骨头的重生具有促进作用。

川芎嗪；血管新生因子；股骨头坏死

股骨头缺血性坏死亦称股骨头无菌性坏死和股骨头坏死(Osteonecrosis of femoral head,ONFH),是指股骨头内细胞因供血不足而死亡引起的骨骼疾病［1］。多种非创伤性因素可造成ONFH,包括肥胖、高血压、酒精中毒和过多使用糖皮质激素等［2-3］。长期激素治疗是常见股骨头坏死的主要原因,但确切的发病机制仍不十分清楚。川芎嗪来源于伞形科植物藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的根,是一种生物碱。研究报道显示:川芎嗪能够改善急性脑出血、急性脑梗死、改善微循环、抗血栓等［4-8］。本文通过构建兔激素性股骨头缺血坏死模型,采用盐酸川芎嗪进行治疗,旨在探讨川芎嗪对激素性股骨头缺血坏死血管新生因子的影响及其促成骨作用,为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验药品、主要试剂与仪器 盐酸川芎嗪注射液(山西康意制药有限公司,国药准字H20057322);地塞米松磷酸钠(天津金耀氨基酸有限公司,国药准字H12020515);抗体如兔抗VEGF、鼠抗 β-actin均购于 Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA),VEGF(MAB-243)SP免疫组织化学试剂盒(福州迈新公司)。主要仪器有CM2000C型病理图像分析仪［北大悦维佳(北京)科技有限公司］,光学显微镜(德国Leica公司)。

1.2 实验动物与分组 选取28只健康新西兰大白兔,雌雄各半,体质量(2.5±0.6)kg,随机分成A、B 2组,A组10只,每周肌注2次生理盐水,为对照组;B组18只,每周肌注2次8mg/kg地塞米松磷酸钠造模。连续处理4周后,随机选取A、B 2组各2只大白兔做影像检查并做病理组织切片。证实造模成功后,将B组随机分成模型组和治疗组,每组8只。治疗组每天清晨耳缘静脉注射14mg/kg盐酸川芎嗪注射液1次,对照组和模型组每天清晨耳缘静脉注射1.5mL生理盐水1次,共注射8周。

1.3 实验方法

1.3.1 Western blot检测VEGF表达:动物治疗4周后,处死。根据钱德慧［9］相关方法提取旋股动脉和股静脉血管细胞总蛋白,进行蛋白定量。调整蛋白浓度,采用15%SDS-PAGE凝胶进行电泳,随后转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上。用含5%脱脂奶粉的封闭缓冲液封闭3h。室温下与一抗(1∶1000)结合2 h,PBS清洗后与二抗结合2 h,ECL发光试剂于暗室内曝光显影。

1.3.2 数字减影血管造影观察血管数:采用5%水合氯醛溶液2mL/kg麻醉新西兰大白兔,切开局部,使股动脉显现,20号针头穿刺成功后,采用 Hicor数字减影系统,用碘普罗胺10mL,注入速度为1mL/s,并以15张/秒的速度采片。股骨头至大粗隆下缘之间区域为A区,粗隆下缘以下区域为B区,观察并计数股骨头供血血管数。

1.3.3 显微镜下观察空骨陷窝:动物处死后,于无菌条件下取出新西兰大白兔两侧股骨头,10%福尔马林缓冲液固定24 h,用15%的EDTA脱钙液加微波辐射进行脱钙,流水冲洗,70%乙醇脱水,石蜡包埋,切成约5μm后的切片,在显微镜下随机选取3个区域,观察计数50个骨陷窝,并找出空骨陷窝数,计算空骨陷窝率,取3个区域的平均值。空骨陷窝率=空骨陷窝数/50×100%。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0进行统计分析,正态计量数据用“±s”表示,组间比较采用t检验;以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组VEGF表达结果比较 Western blot结果显示:与对照组相比,模型组VEGF表达量显著降低(P＜0.01);与模型组相比,治疗组VEGF表达量增加,差异有统计学意义(P＜0.01,见图 1)。

图1 各组VEGF蛋白表达结果Fig.1 Results of VEGF expression in each group

2.2 各组血管数观察结果比较 数字减影血管造影结果显示:模型组A、B 2区血管数较对照组减少,差异有显著性。治疗组A区较模型组有所增加,具有统计学意义,B区血管数较模型组增加明显,差异具有显著性(见图2)。

图2 各组分区血管数**P＜0.01,与对照组比较;#P＜0.05,##P＜0.01,与模型组比较Fig.2 The number of blood vessels in each group**P＜0.01,compared with control group;#P＜0.05,##P＜0.01,compared with model group

2.3 各组空骨陷窝率结果比较 显微镜下观察各组空骨陷窝:与正常组相比,模型组空骨陷窝率显著增加(P＜0.01),治疗4周后,与模型组相比,治疗组空骨陷窝率明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01,见表1)。

3 讨论

股骨头坏死是一种常见的骨科疾病,多发生在中年,严重影响患者正常生活。长期大量使用糖皮质激素是股骨头坏死的常见诱因之一［10］。糖皮质激素是一种强血管生成抑制剂,能通过多种方式破坏血液循环,导致局部血液灌流,并能打断股骨头骨细胞的动态平衡,抑制其再生,加速其裂解,最终导致局部缺血引起骨细胞凋亡,其还能抑制坏死骨组织的修复和重建,进一步加剧骨坏死。

目前对股骨头坏死的治疗效果均不理想,有报道显示抗血小板聚集药物有望用于该疾病的治疗［11］。近年来对川芎嗪的研究发现,其具有急性脑出血、急性脑梗死、改善微循环、抗血栓等作用［5-8］,而川芎嗪用于激素性股骨头缺血坏死的研究尚未见报道。

构建激素性股骨头坏死模型,多选取兔为模式动物［4,11-13］。本文选用新西兰大白兔,通过注射地塞米松钠肌构建激素性股骨头坏死模型,再予以盐酸川芎嗪治疗。结果显示:盐酸川芎嗪能够促进激素性股骨头坏死模型兔中血管新生因子VEGF的表达,增加股骨头供血血管数,降低空骨陷窝率。表明川芎嗪对激素性股骨头缺血坏死兔模型有一定的改善作用,是潜在的治疗激素性股骨头坏死的药物。

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(编校:吴茜)

Effects of tetramethylpyrazine on the angiogenesis and osteogenesis of steroid-induced osteonecrosis in rabbits

LIBao-lin,HU Yong

(Department of orthopedics,Hainan Nongken Nada hospital,Danzhou 571700,China)

Objective To investigate the effect of tetramethylpyrazine on the angiogenic factor and osteogenesis of steroid-induced osteonecrosis in rabbits.Methods New Zealand white rabbitswere divided into normal control group,model group and treatment group.The animalswere sacrificed after 8 weeks experiment,Western blotassay to detect the expression of VEGF in femoral artery and femoral vein,digital subtraction angiography to detect the number of femoral vessels and high-powered microscope to detect rate of empty lacunae.Results The expression of VEGF in femoral artery and femoral vein was higher thanmodelgroup and the differencewas significant(P＜0.01);the number of femoral vascular on treatmentgroup wasmore thanmodel group and the differencewas statistically significant;the rate of empty lacunae on treatmentgroup was lower thanmodel group with statistical significance(P＜0.01).Conclusion Tetramethylpyrazine could unregulate the expression of angiogenic factor in rabbitmodel of steroid-induced osteonecrosis,and the rebirth of the femoral head is facilitated.

tetramethylpyrazine;angiogenic factors;osteonecrosis

R274

A

1005-1678（2014)06-0069-03

李宝林，男，本科，副主任医师，研究方向：骨科临床，E-mail：linbaolin852@126.com。