丹参川芎嗪注射液对妊娠期高血压模型大鼠的疗效及胎盘细胞Cyclin B1和p21蛋白的影响

肖丽,赵梅花,刘香环,李坤

(1.山东省交通医院 妇产科,山东 济南 250031;2.山东省济南市商河县人民医院 妇产科,山东 济南 250031;3.山东省医学科学院附属医院 妇产科,山东 济南 250031)

丹参川芎嗪注射液对妊娠期高血压模型大鼠的疗效及胎盘细胞Cyclin B1和p21蛋白的影响

肖丽1,赵梅花2,刘香环1,李坤3

(1.山东省交通医院 妇产科,山东 济南 250031;2.山东省济南市商河县人民医院 妇产科,山东 济南 250031;3.山东省医学科学院附属医院 妇产科,山东 济南 250031)

目的 探讨丹参川芎嗪注射液对妊娠期高血压大鼠模型的效果及对胎盘细胞CyclinB1、p21蛋白表达量的影响。方法将64只孕鼠随机分为4组:正常妊娠大鼠作空白对照，妊娠高血压大鼠作阴性对照，硫酸镁治疗组作阳性对照，丹参川芎嗪注射液组为实验组；每组16只。妊娠14 d时，尾静脉注射亚硝基左旋精氛酸甲酯建立妊娠期高血压模型。从妊娠第14天开始给药，空白对照组及阴性对照组均给予与药物同剂量的生理盐水；阳性对照组及实验组给予硫酸镁及丹参川芎嗪注射液治疗，3 d为一个给药疗程。通过大鼠套尾法测量血压，尾静脉取血法测定24 h尿蛋白，并观察各组妊娠大鼠所生新生鼠的身长、体重、死胎率、后肢畸形率和胎盘重量，并通过免疫蛋白印迹法测定各组大鼠胎盘细胞中CyclinB1、p21蛋白表达量。结果 与空白组相比，阴性对照组孕鼠尿蛋白及血压明显增加，新生鼠的身长、体重和胎盘重量均显著降低，死胎率以及畸形率显著增高（P＜0.05)；与阴性对照组相比，阳性对照组和实验组孕鼠收缩压及尿蛋白浓度均显著降低，新生鼠的身长、体重和胎盘重量均显著升高，死胎率以及畸形率显著减少（P＜0.05)；阳性对照组及实验组各指标差异无统计学意义。与空白对照组比较，阴性对照组孕鼠CyclinB1蛋白浓度显著下降（P＜0.05)，p21浓度显著增高（P＜0.05)；与阴性对照组相比，阳性对照组和实验组孕鼠CyclinB1蛋白浓度显著升高（P＜0.05)，p21浓度显著降低（P＜0.05)；阳性对照组与实验组相比较，差异无统计学意义。结论 川芎嗪注射液能够显著降低妊娠高血压孕鼠的死胎率以及畸形率，改善新生鼠状况，并且能够上调cyclinB1以及下调p21表达，这可能是川芎嗪注射液治疗效果的原因之一。

丹参川芎嗪注射液；妊娠期高血压；CyclinB1蛋白；p21蛋白

妊娠期高血压疾病是临床上极为常见的妊娠期疾病,包括:妊娠期高血压、原发高血压并妊娠、继发高血压合并妊娠、先兆子痫等［1］。该疾病常常合并产科出血、感染、抽搐,是目前造成孕产妇死亡的主要原因之一。临床研究表明,妊娠期高血压疾病的发生发展与胎盘组织细胞凋亡及凋亡调控蛋白表达失衡有一定的相关性,临床治疗该疾病目前以硫酸镁为主［2］。但是,硫酸镁治疗该疾病面临着毒性大的危险。因而,需要寻找代替硫酸镁的新型治疗妊娠期高血压疾病药物成为研究热点［3］。丹参川芎嗪注射液具有解痉、降压作用,对心肌梗死、高血压等疾病效果良好［4］。本研究以妊娠期高血压大鼠为疾病模型,用丹参川芎嗪注射液治疗获得良好的效果,结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究选用清洁级雌性SD大鼠80只,大鼠体质量220～260 g,购自南京君科生物工程,合格证号:SCXK(鲁)2008-0020;再购取80只雄性SD大鼠,体质量220～260 g,实验期间大鼠饲养于动物房中,保持室温在18℃～28℃之间,环境清洁、光线适中、饮食正常。

1.2 研究方法

1.2.1 妊娠高血压疾病模型建立:雌雄大鼠混养,第二天检查雌性大鼠阴道的精子,发现精子的大鼠计为妊娠大鼠,为妊娠第一天d1。将64只孕鼠按照随机数字表法均分为4组:空白对照组、阴性对照组、阳性对照组、实验组,每组16只。将阴性对照组、阳性对照组、实验组孕鼠进行妊娠高血压模型建立:给予该3组大鼠于d14静脉注射一氧化氮和酶抑制剂(美国Sigma),给药剂量为7mg/(kg·d),连续4 d。空白对照组大鼠:从d14开始,每天定时给予静脉注射生理盐水800 uL/d,连续4 d。

1.2.2 给药方法:空白对照组和阴性对照组:于d18开始,给予大鼠尾静脉注射生理盐水,0.8 mL/d,连续3 d。阳性对照组:于 d18开始,给予大鼠尾肌肉注射硫酸镁溶液,100mg/(kg·d),连续3 d。实验组:于d18开始,给予大鼠尾静脉注射丹参川芎嗪注射液,10mg(kg·d),连续3 d。

1.3 指标测定

1.3.1 孕鼠血压测量:应用HX-II小动物血压测量计(北京明心痛生物科技有限公司),然后通过Medlab生物信号采样分析系统(南京美易科技)通过套尾法测定大鼠尾部动脉收缩压。

1.3.2 24 h尿蛋白测定:从d14天开始收集各组孕鼠24 h尿液,测定其体积,并且取其中1 mL通过考马斯亮蓝测定尿蛋白浓度。

1.3.3 胎盘组织处理:于 d21,采用10%的水合氯醛(3mL/kg)对孕鼠进行麻醉。将大鼠进行剖宫,测定胎鼠的身长、重量、死胎率、畸形胎率。并取胎盘组织适量,用PBS洗2遍之后,用眼科剪剪碎,采用研磨器研成匀浆,通过200目尼龙网过滤后,即得单细胞悬液。

1.3.4 CyclinB1以及p21蛋白的测定［5］:采用免疫蛋白印迹法(Western blot)检测所获得胎盘细胞中CyclinB1以及p21蛋白的表达量,具体操作步骤如下:收集取胎盘组织中的细胞,加入细胞裂解液,冰上裂解提取蛋白。取30 ug定量样品,用SDSPAGE电泳分离后将蛋白转移至PVDF膜上,然后用5%脱脂牛奶-TBST,室温摇床封闭2 h,一抗在37℃孵育3 h,二抗于37℃孵育1 h,ECL发光剂刺激荧光,压片显影定影。用灰度扫描仪处理分析结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0数据统计分析软件,对计数资料采用χ2分析,正态计量资料采用t检验,用“±s”表示;以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组孕鼠血压及尿蛋白浓度测定 给药前,空白对照、阳性对照、阴性对照、实验组孕鼠血压以及尿蛋白浓度结果无显著性差异,且与未妊娠的大鼠差异无统计学意义。表明在建立模型前各雌鼠未孕。在建立模型之后,阳性对照组、阴性对照组、实验组收缩压以及尿蛋白浓度均显著高于空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。在给药治疗后阳性对照组、实验组孕鼠收缩压及尿蛋白浓度均显著高于阴性对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);阳性对照组及实验组差异无统计学意义(见表1)。

表1 各组孕鼠血压及尿蛋白浓度比较Tab.1 Comparison of blood pressure and urine protein concentration each group

2.2 各组孕鼠胎盘重量、死胎率、新生鼠情况比较 研究 结果显示,在建立模型之后,阴性对照组新生鼠体质量、身长、以及胎盘重量均显著低于空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组及阳性对照组新生鼠体质量、身长、以及胎盘重量均显著高于阴性对照组(P＜0.05),但实验组及阳性对照组差异无统计学意义;阴性对照组新生鼠死胎率、畸形率均显著高于空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),实验组以及阳性对照组新生鼠死胎率、畸形率均显著低于阴性对照组(P＜0.05),实验组与阳性对照组无差异(见图1)。

图1 各组孕鼠胎盘重量、死胎率、新生鼠情况比较ΔP＜0.05,与空白组相比;*P＜0.05,与模型组相比Fig.1 Comparison of placenta weight,body weight,body length,deformity rate and mortality in each groupΔP＜0.05,compared with control group;*P＜0.05,compared with model group

2.3 Western blot检测cyclinB1、p21蛋白浓度结果 研究结果显示:与空白对照组相比,阴性对照组孕鼠cyclinB1蛋白浓度显著降低(P＜0.05),p21浓度显著增高(P＜0.05);与阴性对照组相比,阳性对照组和实验组孕鼠cyclinB1蛋白浓度显著升高(P＜0.05),p21浓度显著降低(P＜0.05);阳性对照组与实验组相比较,差异无统计学意义(见图2)。

图2 各组cyclinB1、p21蛋白表达比较ΔP＜0.05,与空白组相比;*P＜0.05,与模型组相比Fig.2 Comparison of cyclinB1,p21 protein expression in each groupΔP＜0.05,compared with control group;*P＜0.05,compared with model group

3 讨论

妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病［6］,也被称为“胎盘病”。它是一组妊娠与高血压并存的疾病,主要包括子痫前期、子痫、以慢性高血压并发子痫前期以及妊娠期高血压等［7］。多犯病于妊娠晚期,其典型症状主要由于高血压、蛋白尿以及水肿。当出现抽搐昏迷,血压明显增高,蛋白尿增多时,则会危机母婴的生命［8］。该疾病的发病率在我国目前达到9.4% ～10.4%［9］。是目前孕产妇以及围生儿发病率、死亡率的主要原因之一［10］。因而,诊断及治疗该疾病是妇产科研究的重点。目前,硫酸镁是治疗该疾病的主要药物之一,但是,临床研究表明,该药物副作用大。因而,寻找更为有效且安全的药物极为重要［11］。

丹参川芎嗪注射液包括丹参、盐酸川芎嗪,并以甘油为辅料。丹参素能够改善血管微循环,能够促进纤维蛋白的溶解,使血液血流状况得到改善,微循环障碍得到减轻,并且能够延长戊巴比妥对大脑皮层的作用,使大脑皮层自发活动减少［12］。川芎嗪能够增加血流量、改善微循环,增加胎盘血流量,抑制血栓烷A的分泌。董喜英等［13］研究发现丹参注射液联合小剂量阿司匹林治疗妊娠期高血压疾病,结果发现疗效良好,值得临床推广。

CyclinB1蛋白是周期蛋白中的一种,能够与细胞核内的Cdk1结合成复合物,该复合物倍cdc25c活化之后才能导致细胞有丝分裂［14］。p21蛋白是一种广泛应用的细胞周期复兴调控因子,能够抑制CDK1,与其特异性结合使其失活,使细胞周期被阻滞,从而促进细胞的凋亡［15］。

本研究通过建立妊娠期高血压大鼠模型,采用丹参川芎嗪注射液及硫酸镁治疗该大鼠模型。结果显示:丹参川芎嗪注射液与硫酸镁在改善大鼠血压以及尿蛋白浓度方面差异无统计学差异,对新生鼠的身长、胎盘重量方面差异也无统计学意义。表明丹参川芎嗪能够起到很好的降血压,治疗妊娠高血压的作用,并且副作用小。通过测定胎盘细胞CyclinB1蛋白以及p21蛋白发现,丹参川芎嗪注射液能够上调CyclinB1蛋白以及下调p21蛋白的表达,这可能是该注射液能够治疗大鼠妊娠期高血压的机制之一。目前该药物还仅限于动物实验模型阶段,其应用于临床还有待进一步研究。

［1］ De Vera MA，Bérard A.Antidepressant use during pregnancy and the risk of pregnancy-induced hypertension［J］.British journal of clinical pharmacology，2012，74（2):362-369.

［2］ Katon WJ，Russo JE，Melville JL，et al.Depression in pregnancy is associated with preexisting butnot pregnancy-induced hypertension［J］.General hospital psychiatry，2012，34（1):9-16.

［3］ 张波，温权，甘元华.丹参川芎嗪注射液治疗高血压脑出血对外周血C反应蛋白的影响研究［J］.中国药物与临床，2013，13（12):1599-1600.

［4］ Honetschlagerova Z，Kitada K，Huskova Z，et al.Antihypertensive and renoprotective actions of soluble epoxidehydrolaseinhibitionin ANGII-dependentmalignant hypertension are abolished by pretreatmentwith LNAM［J］.JHypertens，2013，31（2):321-332.

［5］ 席伟，王建生，张明洁.丹参川芎嗪注射液治疗妊娠期高血压疾病对患者Hcy和VWF水平的影响［J］.微循环学杂志，2013，43（3):35-36.

［6］ 乐杰，谢幸，丰有吉.妇产科学［M］.第6版.北京:人民卫生出版社，2005:97-104.

［7］ 郭玲，左慧君，刘丝荪.妊娠期高血压疾病病因学的研究进展［J］.实验与检验医学，2014，32（4):414-418.

［8］ Shiozaki A，Matsuda Y，Satoh S，et al.Impact of fetal sex in pregnancyinduced hypertension and preeclampsia in Japan ［J］.Journal of reproductive immunology，2011，89（2):133-139.

［9］ 范静，李会琴，郭樱.丹参川芎嗪对妊娠期高血压疾病大鼠的疗效分析［J］.现代妇产科进展.2013，22（9):73-75.

［10］梁跃雄.丹参川芎嗪对高血压性脑出血血肿吸收及神经功能的影响［J］.临床与实践，2012，9（11):32-33.

［11］ Felipe Flores-Suarez， Rainer Birck.Herbal treatments of glomerulonephritis and chronicrenal failure:Review and recommendations for Research ［J］.Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy，2011，3（9):124-136.

［12］ Wilson M L，Brueggmann D，Desmond D H，et al.A fetal variant in the GCM1 gene is associated with pregnancy induced hypertension in a predominantly hispanic population ［J］.International journal of molecular epidemiology and genetics，2011，2（3):196.

［13］董喜英，王春霞，李录花.丹参注射液联合小剂量阿司匹林治疗妊娠期高血压疾病疗效观察［J］.中国煤炭工业医学杂志，2014，17（8):1284-1286.

［14］ May M，Wang T，Muller M，etal.Difference in F-Actin depolymerization induced by toxin B from the variant clostridium difficile serotype F striain 1470［J］.Toxins（Basel)，2013，5（1):106-119.

［15］ Ehrenthal DB，Jurkovitz C，Hoffman M，et al.Prepregnancy body mass index as an independent risk factor for pregnancy-induced hypertension［J］.Journal ofWomen's Health，2011，20（1):67-72.

(编校:吴茜)

Effect of salvia ligustrazine injection on the efficacy of hypertension pregnancy model ratsand the expression of placental cell Cyclin B1 and p21 protein

XIAO Li1,ZHAOMei-hua2,LIU Xiang-huan1,LIKun3

(1.Department of Obstetrics and Gynecology,Traffic Hospital of Shandong Province,Ji'nan 250031,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,People's Hospital of Shanghe county,Ji'nan 250031,China;3.Department of Obstetrics and Gynecology,Affiliated Hospital of Shandong Provincial Academy of Medical Sciences,Ji'nan 250031,China)

Objective To investigate the effects of salvia injection on the effect of TMP ratmodel of hypertension in pregnancy and placental cells CyclinB1,p21 protein expression.Methods 64 rats during pregnancywere divided into four groups:normal pregnant rats as control,pregnancy-induced hypertension rats as negative control,pregnancy-induced hypertension rats treated with magnesium sulfate as positive control,pregnancy-induced hypertension rats treated with salvia ligustrazine injection as experimental group,each had 12 rats.Control group and negative group ratswere given the same dose of the drug saline;positive group and the experimental group were separately givenmagnesium sulfate and salvia ligustrazine injection therapy,three days a dosing regimen.Blood pressure in rats tailsweremeasured,24 h urine protein though tail vein blood were determined,newborn ratsweight,still birth rate,limb deformity rate and placental weight of pregnant rats in each group were observed,and placental cell CyclinB1,p21 protein expression were detected by Western blott.Results Compared with control group,blood pressure and urine protein of pregnant rats in negative control group,were increased significantly(P＜0.05),neonatal height,weight and placentalweightwere decreased significantly(P＜0.05),and the stillbirth rate andmalformation ratewas significantly higher(P＜0.05).Compared with negative controlgroup,blood pressure and urine protein of pregnant rats in positive control group and experimental group were decreased significantly(P＜0.05),neonatal height,weight and placental weight were increased significantly(P＜0.05)and the stillbirth rate and malformation rate was significantly lower(P＜0.05).There were no significant differences of thoseindexes between positive control group and experimental group.Compared with control group,cyclinB1 protein expression in negative control group was decreased(P＜0.05),and p21 was significantly increased(P＜0.05),Compared with negative control group,cyclinB1 protein expression in positive control group and experimental group were all increased(P＜0.05),ang p21 was significantly decreased(P＜0.05).There were no significant differences of those indexes between positive control group and experimental group.Conclusion TMP injection can significantly reduce pregnancyinduced hypertension in pregnant rats and deformity rate,stillbirth rate,neonatal rats situation also improved,and can increase cyclinB1 expression and decrease p21 expression,which may be one of the therapeutic effect of TMP injection reasons.

salvia ligustrazine injection;gestational hypertension;CyclinB1 protein;p21 protein

TQ460.7

A

1005-1678（2014)06-0055-04

山东省自然科学基金课题(ZR2009CL027)；济南市科技局科技明星计划课题(20100118)；山东省医学科学院医学基金课题(201023)

肖丽，女，硕士，主治医师，研究方向：妊娠期高血压，E-mail：qch1821460022@163.com。