子痫前期患者胎盘中m iRNA-1O1和内质网蛋白ERp44的表达和意义

常玉华,李坤

(1.山东省交通医院 妇产科,山东 济南 250031;2.山东省医学科学院附属医院 妇产科,山东 济南 250031)

子痫前期患者胎盘中m iRNA-1O1和内质网蛋白ERp44的表达和意义

常玉华1,李坤2

(1.山东省交通医院 妇产科,山东 济南 250031;2.山东省医学科学院附属医院 妇产科,山东 济南 250031)

目的 探讨子痫前期患者胎盘中miRNA-101和内质网蛋白ERp44的表达和意义。方法 选取2013年5月～2014年5月入住山东省交通医院分娩的100例产妇的胎盘绒毛组织，随机均分为对照组和子痫前期组，每组各50例。采用RT-PCR法检测各组胎盘组织中miRNA-101的表达情况；Western blot法检测过表达和封闭miRNA-101后，各胎盘组织ERp44的表达情况；采用流式细胞仪检测滋养细胞的凋亡情况。结果 与对照组相比，子痫前期组中miRNA-101的表达明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05)。在滋养细胞HTR-8/SVneo中过表达miRNA-101后，ERp44的表达显著下调（P＜0.05)；封闭miRNA-101后，ERp44的表达上调（P＜0.05)；过表达miRNA-101，细胞凋亡数量减少；封闭miRNA-101，细胞凋亡数量增加。结论 子痫前期中，miRNA-101可通过调控内质网蛋白ERp44的表达来调控胎盘滋养细胞的凋亡过程。

miRNA-101；内质网蛋白ERp44；滋养细胞；子痫前期

子痫前期(preeclapmpsia,PE),是一种十分常见的妊娠并发症,其发病率约为3%～5%［1-2］,临床表现以蛋白尿和高血压为主,并伴有周身小血管痉挛和多脏器损伤,是造成围生期母婴死亡的主要原因之一［3-5］。目前,对于子痫前期的病因及发病机制并不十分清楚,临床上通常采用解除血管痉挛和降血压等对症治疗,但其预后并不理想。在以往的治疗病例中发现,子痫前期多发生在妊娠20周胎盘功能成熟后,而当患者娩出胎盘后,与子痫前期相关的各种症状得以迅速缓解［6-7］。表明子痫前期可能是一种胎盘相关性疾病。胎盘作为妊娠的天然屏障,在妊娠过程中起着十分重要的作用。胎盘主要功能细胞是滋养细胞,它是胚胎与母体直接接触的部分,能够产生细胞粘附分子,趋化因子等,从而保证妊娠的正常进行［8-9］。近年来研究表明,胎盘滋养层细胞发生凋亡与子痫前期的发病密切相关,而滋养层细胞凋亡主要与内质网应激介导的凋亡途径有关［10-11］。正常情况下,内质网应激可使机体免受损伤,但当应激过强时则会激活某些与细胞凋亡相关的信号通路,使细胞发生程序性死亡［12-13］。因此胎盘中内质网的应激与子痫前期的发病密切相关。研究表明,子痫前期患者胎盘内质网中ERp44蛋白、ERp60蛋白和蛋白质二硫键异构酶出现表达上调的现象,其中ERp44蛋白的表达高出正常孕妇的数倍,表明ERp44蛋白与子痫前期的发病密切相关［14-15］。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类广泛存在于真核生物中的非编码单链RNA分子,可通过抑制靶mRNA的翻译,调控目的基因的表达,达到调控细胞分化、增殖和凋亡的目的。因此内质网蛋白ERp44的表达很可能也受到miRNA的调控。本研究旨在通过检测子痫前期孕妇和正常孕妇胎盘组织中miRNA和ERp44的表达情况,探讨miRNA-101与ERp44在子痫前期滋养细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料 随机选取2013年5月～2014年5月入住山东省交通医院分娩的100列产妇的胎盘绒毛组织,对照组和子痫前期组各50例,年龄24～29岁,平均(26±2)岁,2组年龄无统计学差异。所有标本均在受试者知情同意后收集,除患者签署知情同意书外还得到医院伦理委员会的批准。排除标准:①有先天性遗传性疾病;②有子宫肌瘤等妇科疾病;③多胎;④有其他妊娠期并发症;⑤有高血压、心脏病,肾炎等原有基础病。

1.2 材料

1.2.1 标本取材:所有标本均取自分娩后近脐带部位的无钙化和无坏死的绒毛组织。标本取材后用PBS淋洗3次,于离体20min之内取新鲜组织60mg,立刻冻存于-72℃冰箱。在2h之内提取所有标本的总RNA,然后立刻逆转录成cDNA,再置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 细胞及试剂:HTR-8/SVneo人滋养细胞(中国科学院上海细胞研究所)。TrizolRNA试剂盒(美国Invitrogen公司),M-MuLV反转录酶(美国NEB公司),5U/μLTaqDNA聚合酶(广州东盛生物科技有限公司),ERp44单克隆抗体(DAKO公司,美国),羊抗兔二抗(北京中衫金桥公司,中国),miRNA-101 mimics、miRNA-NCinhibitor、anti-miRNA-NCinhibitor和 antimiRNA-101均购自美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 人滋养细胞HTR-8/SVneo培养和处理:HTR-8/SVneo细胞用含10%胎牛血清、青霉素1×105IU/L、链霉素100mg/L的DMEM高糖培养基于37℃,5%CO2培养箱内培养。细胞融合到85%左右时,用0.25%胰酶消化,以5×105的密度接种于6孔板,培养24h待细胞贴壁。

1.3.2 RT-PCR法检测2组胎盘组织中miRNA-101的表达:采用 Trizol法提取离体胎盘组织细胞的RNA,反转录成cDNA。具体实验操作按照RT-PCR试剂盒的说明进行,反应体系为50μL,94℃下先预变性4min,然后按照94℃,30s;60℃,60s;72℃,120s,进行30个循环,最后72℃下延伸10min。取RT-PCR的产物10uL进行电泳,相对分子质量标准采用pucMix Marker,使用凝胶扫描系统扫描目的基因和β-actin基因的光密度值,目的基因光密度与β-actin基因光密度的比值反映该目的基因mRNA的表达水平。

1.3.3 Westernblot法检测过表达和封闭miRNA-101对ERp44蛋白表达的影响:HTR-8/SVneo人滋养细胞培养于6孔板。过表达 miRNA-101:细胞转染 miRNA-101mimics增强剂(miRNA-NCinhibitor抑制剂为阴性对照);封闭miRNA-101:细胞转染anti-miRNA-101抑制剂(anti-miRNA-NCinhibitor为阴性对照)48h后进行过表达和干扰效率检测。收集细胞,然后提取各组细胞蛋白。取煮沸后的蛋白质样品用SDS-PAGE电泳分离,然后转移至Millipore膜。用脱脂奶粉封闭1h后,用ERp44单克隆抗体4℃孵育过夜,紧接着用辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育,采用ECL放射自显影法。最后将胶片扫描,分析目标带的分子量和光密度值,β-actin作为内参对照,2者光密度比值即为目的蛋白的相对表达水平。

1.3.4 流式细胞仪检测经转染的HTR-8/SVneo细胞凋亡:HTR-8/SVneo人滋养细胞转染48h后,用0.25%胰酶消化,4℃下离心5min,弃去上清,加10μLAnnexinVFITC荧光探针和5μL的碘化丙锭,避光室温孵育20min。流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件,正态计量数据以“±s”表示,2组间的资料比较采用t检验,相关分析采用Pearson法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组胎盘组织中miRNA-101的表达比较 RT-PCR结果显示:子痫前期组和正常对照组的产妇胎盘中miRNA-101的相对表达量分别为(0.41±0.02)和(0.82±0.03),2组比较差异有统计学意义(P＜0.05,见图1)。

图1 RT-PCR检测2组miRNA-101的表达Fig.1 TheexpressionofmiRNA-101intwogroupstestedbyRT-PCR

2.2 在HTR-8/SVneo细胞过表达和抑制miRNA-101后对ERp44蛋白表达的影响 Westernblot结果显示:过表达miRNA-101组中ERp44的表达显著下调,是转染miRNA-101NC组的数十倍;而转染anti-miRNA-101组中的ERp44表达也高于转染anti-miRNANC组(见图2、表2)。说明子痫前期患者胎盘组中的miRNA-101基因表达与ERp44蛋白的表达呈负相关,miRNA-101可能通过调控ERp44的表达在子痫前期的发病中起着一定的作用。

图2 过表达和抑制miRNA-101基因后对ERp44蛋白表达的影响Fig.2 EffectofoverexpressionorinhibitionofmiRNA-101onERp44expression

表2 各组ERp44蛋白表达比较Tab.2 Comparison of ERp44 expression in each group

2.3 miRNA-101对HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示:在HTR-8/SVneo人滋养细胞中过表达miRNA-101,细胞凋亡显著减少;封闭miRNA-101表达后,细胞凋亡数量显著增加(见图3)。

图3 流式细胞仪检测mi RNA-101对滋养细胞凋亡的作用A:miRNA-NC;B:miRNA-101 mimics;C:anti-miRNA NC;D:anti-miRNA-101Fig.3 Effect ofmiRNA-101 on apoptosis of trophoblast cells tested by flow cytometryA:miRNA-NC;B:miRNA-101 mimics;C:anti-miRNA NC;D:anti-miRNA-101

3 讨论

微小RNA是近几年来发现的一类广泛存在的非编码单链RNA分子,由19～25个核苷酸构成［16］。miRNA能够通过对靶mRNA的抑制和降解作用,对目的基因的转录翻译进行调控,从而进一步调控细胞分化、增殖和凋亡［17］。研究表明,miRNA可以参与机体许多重要的生理病理过程。近年来,其对子痫前期中滋养细胞凋亡的调控作用成为研究的热点［18］。有文献报道,子痫前期的发生涉及到很多miRNAs的异常表达,在许多重度子痫前期患者中,miRNA都出现表达下调的现象。本研究通过对50例子痫前期和50例正常妊娠的孕妇胎盘组织中miRNA-101的水平检测,发现子痫前期患者miRNA-101的表达显著性低于正常对照组,表明miRNA-101可能参与了子痫前期的发病过程。

子痫前期往往伴随着滋养细胞的凋亡,而滋养细胞是母体与胚胎直接接触的部分,是胎盘的主要功能细胞。本研究结果显示,过表达miRNA-101会使得滋养细胞凋亡数目显著减少,而封闭miRNA-101的表达则可促使滋养细胞凋亡。研究说明,胎盘滋养层细胞发生凋亡与子痫前期的发病密切相关,而滋养层细胞凋亡主要与内质网应激介导的凋亡途径有关。一般正常情况下,内质网应激可使机体免受损伤,但当应激过强时则会激活某些与细胞凋亡相关的信号通路,使得细胞发生程序性死亡。本研究还显示miRNA-101的表达与ERp44的表达呈负相关,说明miRNA-101可能通过调控内质网蛋白ERp44的表达参与子痫前期的发病。

综上所述,在子痫前期中,miRNA-101表达下调可使内质网应激蛋白ERp44的表达增加。下一步将对与内质网应激蛋白ERp44的表达增加相关的信号通路进行研究,探讨促使胎盘滋养细胞凋亡的具体机制。

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(编校:吴茜)

m iRNA-1O1 regulates apoptosis of trophoblast cells in preeclampsia by targeting endoplasm ic reticulum protein 44

CHANG Yu-hua1,LIKun2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology,Traffic Hospital of Shandong Province,Ji'nan 250031,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,Affiliated Hospital of Shandong Province Academy of Medical Sciences,Ji'nan 250031,China)

Objective To explore the possiblemechanism ofmiRNA-101 regulates endoplasmic reticulum protein ERp44 and apoptosis of placental trophoblast in preeclampsia.Methods 100 cases experimental object from May 2013 to May 2014 in our hospital was selected and divided into two groups.ThemiRNA-101 expression in two groups were detected by RT-PCR.ERp44 expression were detected by western blot when overexpressed and inhibited miRNA-101.At the same time,the number of cell apoptosis was tested by Flow cytometry.Results Compared with control group,the expression ofmiRNA-101 in PE group were decreases(P＜0.05).The level of ERp44 was elevated and the number of cell apoptosis reduced after miRNA-101 overexpression;the level of ERp44 was declined and the number of cellapoptosis increased after inhibite the expression ofmiRNA-101(P＜0.05).Conclusion mi RNA-101 regulates apoptosis of trophoblast cells by regulating the expression of ERp44 in patientswith preeclampsia.

miRNA-101;endoplasmic reticulum protein 44;trophoblast cells;preeclampsia

R714.245

A

1005-1678（2014)06-0038-04

山东省自然科学基金(ZR2009CL027)；山东省医学科学院医学基金(201023)

常玉华，女，本科，主治医师，研究方向：妇产科学，E-mial：qch1821460008@163.com。