靶向抑制DNA拓扑异构酶的抗肿瘤药物研究

钱晨 彭再利 巢晖

(中山大学化学与化学工程学院 广东广州510275)

无论在原核或真核细胞中，天然状态的DNA都主要以超螺旋的形式存在。在DNA的转录、复制以及基因表达过程中，DNA双螺旋链需要在超螺旋状态与解旋状态之间不断进行转换。为了解决DNA在代谢过程中出现的构象问题，生物在长期进化的过程中演化出了DNA拓扑异构酶(topoisomerase，Topo)，可通过催化作用改变DNA的拓扑结构［1］。研究发现，与正常细胞不同，拓扑异构酶在肿瘤细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达。因此抑制DNA拓扑异构酶的活性就能阻止肿瘤细胞快速增殖，进而诱导肿瘤细胞的凋亡及坏死。近年来，以DNA拓扑异构酶为靶点设计各类抑制剂，用作抗癌药物的研究已成为肿瘤化疗的重要途径。本文将对拓扑异构酶的结构、功能及以其为靶点的抗肿瘤药物研究进展进行介绍。

1 DNA拓扑异构酶的结构与功能

拓扑异构酶是通过两个连续的转酯化反应重复断开和连接DNA主链的磷酸二酯键来催化DNA拓扑结构转变，进而直接参与或影响细胞DNA的复制、翻译、转录、重组以及有丝分裂等生命过程［2］。根据拓扑异构酶催化机制的不同，主要将其分为两类:TypeⅠ拓扑结构酶与 TypeⅡ拓扑结构酶［3］。TypeⅠ拓扑结构酶属于单体酶，包括TopoⅠA、TopoⅠB和TopoⅠC 3种亚型，它在作用过程中不需要额外能量因子。TypeⅡ拓扑结构酶是同源二聚体酶，包括TopoⅡα、TopoⅡβ两种亚型［4］。在人细胞中，主要包含DNA拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)和DNA拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)两种，分别归类于TopoⅠB和 TopoⅡα。

1.1 TopoⅠ的结构与功能

TopoⅠ最早是1971年在细菌中发现的，人类TopoⅠ是哺乳动物TopoⅠ的原始型，相对分子质量为100 000，位于染色体20q12～13.2单拷贝基因编码上。TopoⅠ是一种单体酶(图1a)，由756个氨基酸残基组成，其中起催化作用的酪氨酸(Tyr)位于羧基端。TopoⅠ在DNA双链上产生单链断裂，使另一单链从缺口处穿过，改变DNA超螺旋或螺旋化不足的情况。TopoⅠ中的Tyr与DNA 3'断端的磷酸盐以共价键结合，同时在断裂缺口的5'位形成羟基末端(图1b)，5'羟基末端绕另一完整的DNA链旋转，此过程具有可逆性，不需要ATP和二价金属阳离子的参与。这种结构上的特性使TopoⅠ对正超螺旋和负超螺旋DNA具有几乎相同的松弛能力［5］。

图1 TopoⅠ酶的结构(a)及TopoⅠ酶与DNA的结合位点示意图(b)

TopoⅠ催化单链断裂和连接的过程如图2［2］所示:第一步，酶识别结合到特异DNA序列上;第二步，切开单链，酶通过磷酸二酯键与DNA共价结合形成可断裂复合物;第三步，酶在断裂单链上的过渡;第四步，在切开位点上对断裂单链进行重连;第五步，继续解旋，重复应用活化后的可断裂复合物;第六步，解旋之后，酶从DNA上释放出来［6］。

图2 TopoⅠ作用机理图

1.2 TopoⅡ的结构与功能

TopoⅡ最早发现于1980年，人类TopoⅡ也是哺乳动物TopoⅡ的原始型，位于人染色体17q21～22单拷贝基因编码的二聚体蛋白上，表达依赖于细胞周期。TopoⅡ是由两个相同亚基组成的二聚体(图3a)。TopoⅡ在DNA主链上产生双链断裂，使另一条双链DNA从缺口处穿过，在整个过程中需要ATP提供能量。除了能完成所有TopoⅠ的功能以外，TopoⅡ还能在DNA复制完成后分开相互交联的姐妹染色单体。TopoⅡ能对特殊的DNA序列进行识别，并通过Tyr与DNA 5'断端的磷酸基以共价键结合(图3b)［5］，形成易解离复合物，改变DNA的拓扑结构，然后再催化断裂链的重新连接［7］。

图3 TopoⅡ酶的结构(a)及TopoⅡ酶与DNA的结合位点示意图(b)

TopoⅡ可以剪切和打开一股双螺旋链，其催化过程如图4［2］所示:第一步，酶识别结合到特异DNA序列上;第二步，切开双链，酶与DNA断裂后产生的5'端结合，形成酶-DNA共价复合物;第三步，另一完整的双链DNA穿过主链切开的位点，此过程需结合ATP;第四步，在切开位点上对双链进行重连;第五步，与酶结合的ATP酶水解;第六步，酶周转，回到能重新启动催化反应的状态［8］。

图4 TopoⅡ作用机理图

2 DNA拓扑异构酶抑制剂作为抗肿瘤药物的研究

从细菌到人类，拓扑异构酶广泛存在于各种生物体的细胞中。与正常细胞不同的是，拓扑异构酶在肿瘤细胞中均表现出不受其他因素影响的高水平表达，尽管原因尚不清楚，但这却是拓扑异构酶抑制剂对肿瘤细胞具有特殊疗效的细胞学基础。近年来，人们发现许多抗肿瘤药都是通过拓扑异构酶发挥疗效的。因此，以DNA拓扑异构酶为靶分子设计各种抑制剂，并使其成为抗肿瘤药物，已成为肿瘤化疗研究新热点。

2.1 拓扑异构酶抑制剂的作用机理

现今研究业已证实，可通过影响Topo酶作用过程的各个阶段来破坏酶的活性。既可以直接作用于DNA，也可以作用于拓扑异构酶，还可以作用于DNA拓扑异构酶-DNA断裂复合物，来完成对拓扑异构酶活性的抑制，并最终导致细胞凋亡［9］。抑制剂的作用实际上是使细胞内功能正常的拓扑异构酶转变为导致DNA链断裂的致伤物，而细胞死亡的最终原因可能是由于DNA链断裂的错误修复或是由于可断裂复合物的形成及稳定存在，激活了细胞内一系列导致细胞程序性死亡的过程。

大体上来说，DNA拓扑异构酶抑制剂的抑制机理可以分为两种，一种是毒性机理，一种是催化抑制机理。

毒性机理是指抑制剂与Topo-DNA共价复合物形成三元复合物。通过提高Topo-DNA共价复合物的稳态浓度使Topo酶“中毒”。具体地说，在正常情况下，拓扑异构酶能使DNA发生瞬间断裂和重接，但是在药物作用下，TopoⅠ或TopoⅡ在切开单链或双链后，拓扑异构酶与末端DNA以共价键形成一种易解离的复合物(酶-DNA可断裂复合物)(图5)［3］，并使这一可逆的平衡反应趋向于酶-DNA可断裂复合物一侧，从而导致DNA链的断裂，并进一步启动一系列导致细胞死亡的因素。

图5 TopoⅠ/TopoⅡ在拓扑异构酶抑制剂作用下与DNA形成可断裂复合物

与毒性机理不同，催化机理是指抑制剂通过阻滞Topo的某一特定功能或催化反应中的某一步骤，进而抑制Topo总的催化活性。Topo催化抑制剂主要是一些DNA或蛋白酶的结合剂，包括插入剂如阿克拉霉素A和大小沟结合剂如Hoechst33258等，Topo催化抑制剂可以作用在拓扑异构酶催化反应的各步骤，因此其作用机制也不相同。大致可分为3类:①抑制Topo与DNA的结合，通过阻断酶与其底物DNA的接触，化合物可以削弱酶在催化和构象上的功能，如阿柔比星。②稳定Topo-DNA共价复合物，抑制Topo的催化功能，如ICRF-187。③ 阻止ATP键合(仅TopoⅡ)，如新生霉素［10］。

2.2 有机小分子作为DNA拓扑异构酶抑制剂的研究进展

目前对于DNA拓扑酶抑制剂的研究大部分集中在一些生物碱类有机化合物。根据其作用的底物不同，Topo酶抑制剂可以分为TopoⅠ、TopoⅡ抑制剂和TopoⅠ/Ⅱ双重抑制剂。

以TopoⅠ为靶点的抗肿瘤药物主要是喜树碱及其衍生物［11］。喜树碱(camptothecin，CPT)类化合物是从琪桐科植物喜树中分离得到的生物碱，具有较强的细胞毒性，对肺癌、胃癌、肠癌、卵巢癌、膀胱癌及白血病等均有较好疗效;但由于CPT内酯环在生理条件下的不稳定性(图6)及其毒副作用，此类抑制剂的研究重点主要集中在通过对母体CPT的化学结构进行改造，寻求更好的CPT衍生物。目前已有3种CTP类药物在国内外上市，在临床上用于结肠癌、卵巢癌和肺癌等的治疗;还有30多个CPT衍生物正处于临床试验阶段。另外，寻找水溶性更好、细胞毒性更强的CPT衍生物的研究也在持续进行［12-13］。CPT类化合物的作用机制是在TopoⅠ作用过程中与DNA形成可断裂复合物，阻碍DNA链的闭合，导致细胞DNA单链断裂的累积。这种单链断裂对细胞来说并不是致死性的，当可断裂复合物与正在进行复制的DNA复制叉相遇时，会继发地造成不可逆的DNA双链断裂，最终引起细胞死亡(图7)［3］。

图6 CPT在生理条件下的不稳定性

图7 CPT类TopoⅠ抑制剂的作用机制

CPT类抑制剂和TopoⅠ-DNA形成的三元复合物在药物浓度降低以后，会很快被逆转，细胞膜上的转运蛋白将CPT类化合物转运出细胞从而产生耐药性。因此，增强CPT-TopoⅠ-DNA三元复合物的稳定性对此类化合物药效的发挥有着重要意义。支志明等［14］通过分子动力学研究，提出了预测三元复合物稳定性的方法，并总结了具有稳定作用的CPT衍生物的结构特征。

以TopoⅡ为靶点的抗肿瘤药物较多，根据与底物的作用方式不同，将TopoⅡ抑制剂分为TopoⅡ毒剂和TopoⅡ催化抑制剂。毒性机理是指抑制剂与TopoⅡ-DNA形成三元复合物，通过提高复合物的稳态浓度使Topo酶“中毒”，受药细胞基因组DNA产生双链断裂并累积，从而导致细胞变异或死亡。迄今发现的TopoⅡ抑制剂大部分为TopoⅡ毒剂，常见的有阿霉素 (Doxorubicin)，VP-16(Etoposide)，沙尔威辛等。与毒性机理不同，催化抑制机理是指抑制剂通过阻滞TopoⅡ的某一功能或催化反应中的某一特定步骤，进而抑制TopoⅡ总的催化活性。此类药物包括:新生霉素(Novobiocin)、美巴龙(Merbarone)、阿柔比星(Aclarubuxin)、ICRF-193 等［15］(图8)。

研究表明，处于S期的细胞TopoⅡ的含量比较高。TopoⅡ毒剂主要在S期对DNA产生不可逆的双链断裂，最终导致DNA断裂复合物在G2期的积累。TopoⅡ催化抑制剂(如阿柔比星)也主要作用于S期，使超螺旋DNA的松弛在DNA复制前减慢，影响G1期到S期的进程，最终导致细胞周期在G2期停滞［16］。吖啶类化合物作为抗菌、抗癌药物的研究取得了很大进展，而其抗癌作用的原理就在于抑制了TopoⅡ这一关键酶。John R.Goodell等［17］通过研究一系列吖啶类化合物对细胞周期的影响，对该系列化合物作为TopoⅡ抑制剂的抑制机理作出了区分(图9)。

图8 一些常见的TopoⅡ抑制剂

现今，人们在研究以TopoⅠ或TopoⅡ为靶点的抗癌药物方面有了长足的进步，然而以单一拓扑酶为靶点的抗癌药物却存在着很多缺陷。有研究证明，由TopoⅡ抑制剂造成的DNA双链断裂会导致二次恶性肿瘤的发生［18］;另外，选择性地抑制TopoⅠ会引起体内TopoⅡ含量上升;并且，TopoⅠ和TopoⅡ抑制剂联合用药会引起严重的肿瘤细胞多药耐药性，甚至会使两种抑制剂之间发生竞争性抑制，从而降低两种抑制剂各自的药效［19］。TopoⅠ和TopoⅡ双重抑制剂对TopoⅠ和TopoⅡ都有抑制效果，有望解决单一的拓扑酶抑制剂在供药耐受性上的问题，而且它们可以完全抑制DNA、RNA的合成，进而导致细胞死亡。由于它们的抑制能力一般都比较强，可以减小供药浓度太大所引起的毒性问题。

图9 吖啶类TopoⅡ毒剂和TopoⅡ催化抑制剂

大部分TopoⅠ/TopoⅡ双重抑制剂是TopoⅠ和TopoⅡ的双重毒剂，能同时稳定两种拓扑酶与DNA形成的可断裂复合物，从而抑制拓扑酶的活性。例如近几年发现的吩嗪类衍生物XR11576，研究证明它能同时介导TopoⅠ/TopoⅡ-DNA可断裂复合物的形成，是TopoⅠ和TopoⅡ的双重毒剂，并且这种药物对过量表达P-糖蛋白的多药耐药性肿瘤细胞有很好的杀伤效果，现已进入临床前试验阶段。另一种研究比较透彻的TopoⅠ/TopoⅡ双重毒剂茚托利(intoplicine)的作用方式稍有不同，它是通过deep intercalation mode和outside binding mode两种模式分别稳定了TopoⅠ及TopoⅡ与DNA形成的可断裂复合物［20］。

近些年来，TopoⅠ/TopoⅡ双重抑制剂引发了人们日益浓厚的兴趣，一系列不同结构、不同作用机制的双重抑制剂被合成了出来，包括灵菌红素(Prodigiosin)，姜黄素(Curcumin)，吲哚基喹啉衍生物TAS-103等(图10)，其中PZA和茚托利辛已进入临床一期试验阶段［21］。然而，目前关于这些化合物的构效关系以及具体作用机理的研究仍不透彻，这大大制约了这类化合物的应用。至今仍无TopoⅠ/TopoⅡ类双重抑制剂抗癌药物进入市场。

图10 常见的TopoⅠ/TopoⅡ双重抑制剂

2.3 金属配合物作为DNA拓扑异构酶抑制剂的研究进展

目前对于DNA拓扑酶抑制剂的研究主要集中在一些生物碱类有机化合物，金属配合物抑制DNA拓扑异构酶的研究还较少有人涉及。有机类拓扑异构酶抑制剂存在结构复杂、特异性不高、溶解性差、毒性较大等缺点。与有机化合物相比，金属配合物分子结构具有更好的可塑性，容易在配体上引入其他分子活性基团，可以针对不同的底物结合环境进行相应的结构修饰;而且其丰富的光电磁性质将有助于探索某些复杂的生命过程。

自从20世纪80年代，Barton等在研究金属配合物与DNA作用时发现Zn2+，Co3+，Ru2+等配位饱和的八面体手性配合物具有识别DNA二级结构的能力，金属配合物与DNA的识别和结合已成为近年来生物无机化学领域较活跃的研究课题之一。虽然发现不少金属配合物具有识别和断裂DNA功能，但真正在DNA拓扑异构酶抑制方面的具体应用还非常少，至今仅有为数不多的关于金属配合物抑制DNA拓扑异构酶的研究报道，主要集中在铂类、钌类、金类等金属配合物方面。

2.3.1 铂类配合物作为拓扑异构酶抑制剂

铂类配合物作为研究最早的抗肿瘤药物，一直备受研究者关注。2004年，J.H.M.Schellens等研究发现由于顺铂与DNA碱基共价结合，当与喜树碱联合应用时，喜树碱的TopoⅠ抑制活性明显增强［22］。A.H.J.Wang课题组报道了一系列含tpy平面配体的铂配合物［23］，该系列铂配合物是一类有效的TopoⅠ/Ⅱ 双重抑制剂，对TopoⅠ/Ⅱ抑制IC50分别达到了10μmol/L与5μmol/L(图11a)。支志明课题组最近也报道了一系列含修饰tpy配体的铂配合物(图11b)［24-25］，实验显示，该系列铂配合物是TopoⅡ抑制剂;经过修饰之后的铂配合物，对TopoⅡ抑制活性明显提高。铂配合物是通过稳定拓扑异构酶-DNA二元复合物来达到抑制效果的，是典型的TopoⅡ毒剂。

图11 铂配合物拓扑异构酶抑制剂结构式

2.3.2 钌类配合物作为拓扑异构酶抑制剂

钌多吡啶配合物具有既为刚性又带手性的八面体构型，水溶性比较好，热力学性质稳定，不易发生配体取代，易于在近生理条件下开展研究，光化学、光物理信息丰富，毒性低，细胞膜透性较好。1999年，A.K.Kondapi报道配合物［RuCl2(C6H6)(dmso)］可以作为TopoⅡ毒剂，用于抑制肿瘤增殖［26］。而后，他们将DMSO换成嘧啶及嘧啶类衍生物，发现它们具有更好的TopoⅡ毒性，并对乳腺癌和结肠癌表现出更高的细胞毒性［27］。此后，关于以Topo为靶点的钌配合物的报道并不多。我们课题组长期致力于钌配合物抗肿瘤活性的研究。近年来，我们设计合成了一系列具有刚性平面配体的钌多吡啶配合物，并对其抗肿瘤作用机理进行了系统的研究。2007年，我们首次报道了具有TopoⅡ抑制效果的一对手性配合物 Λ-［Ru(bpy)2(uip)］2+和 Δ-［Ru(bpy)2(uip)］2+(图12a)［28］，结果显示，它们对 TopoⅡ具有很强的抑制活性，IC50分别为3μmol/L与5μmol/L。通过抑制机理试验，我们发现这一对手性配合物为TopoⅡ毒剂，可以稳定拓扑异构酶-DNA断裂复合物，并且与传统的TopoⅡ毒剂依托泊苷、玫瑰树碱一样，它们可以直接作用于拓扑异构酶。体外毒性结果显示，配合物对人白血病细胞株、人肝癌细胞株、人宫颈癌细胞株、人鼻咽癌细胞株也表现了良好的抗癌活性。通过引入鸟嘌呤结构，合成了具有特异识别G-C碱基的钌(Ⅱ)多吡啶配合物［Ru(bpy)2(appo)］2+。抑酶活性测定证实该配合物表现出很高的TopoⅡ抑制能力(IC50＜1μmol/L)［29］。进一步研究发现，配合物对拓扑异构酶的抑制活性与钌配合物辅助配体有一定关系［30］。最近，我们又相继报道了4个具有良好TopoⅠ/Ⅱ双抑制活性的钌多吡啶配合物［Ru(bpy)2(bfipH)］2+、［Ru(phen)2(bfipH)］2+(图12b)、Λ/Δ-［Ru(bpy)2(ipad)］2+(图12c)［31-32］，该类配合物对 TopoⅠ/Ⅱ均具有良好的抑制活性，是TopoⅠ/Ⅱ的双重毒剂。细胞毒性实验显示，配合物对人宫颈癌细胞株、人肝癌细胞株、人乳腺癌细胞株等有较好的抑制活性。通过细胞实时分析、单细胞凝胶电泳、AO/EB双染实验和流式细胞术等实验，证明配合物可以造成细胞DNA损伤，进而导致细胞凋亡。目前钌类配合物作为拓扑异构酶抑制剂的抗肿瘤活性研究仅限于体外研究阶段，需要更进一步对其作用机理等进行详细的研究，以确定其作为抗肿瘤药物的临床可能性。

图12 钌配合物拓扑异构酶抑制剂结构式

2.3.3 其他金属配合物作为拓扑异构酶抑制剂

除了铂、钌类金属配合物以外，常见的已用于抗肿瘤药物研究的还有金、镉、钴、镍等金属配合物，但是关于它们作为拓扑异构酶的抑制剂的报道则很少。

支志明课题组最近首次报道了4个单核与双核金配合物，配合物包含一个三联吡啶配体，与金原子形成共平面。研究结果显示，该类配合物是TopoⅠ抑制剂，在小鼠体内显示了很好的肿瘤抑制活性［33］。之后，A.Desideri课题组详细研究了金配合物的拓扑异构酶抑制机理。研究发现，金配合物与喜树碱类抑制机理完全不同，它是通过直接抑制拓扑异构酶的活性来抑制整个催化过程［34］。

此外，S.K.Singh等发现一系列有水溶性的芳烃金属铑配合物有很好的 TopoⅡ抑制作用［35］，D.Jayaraju等研究了一系列钴水杨醛肟类配合物，发现它们是一类很好的DNA插入试剂和TopoⅡ毒剂，能够诱导癌细胞凋亡［36］。近年来，又陆续有一些Cd2+、Ni2+［37-38］金属配合物作为TopoⅡ抑制剂的报道。目前，金属配合物抑制DNA拓扑异构酶的研究还处于起步阶段，有关配合物结构、DNA作用方式及拓扑异构酶抑制功能间相互关系等方面的研究工作都急待开展。

3 结语

拓扑异构酶在DNA的复制、转录、翻译、重组和修复中起着十分重要的作用，现已成为抗肿瘤治疗的一种新靶点。从20世纪70年代发现DNA拓扑异构酶晶体结构至今，经过几十年的努力，人们已经研制出一系列的拓扑异构酶抑制剂作为有效的抗肿瘤药物应用于临床，并对其作用机理做了大量研究。但是抑制剂杀伤癌细胞的机理十分复杂，癌细胞的最终死亡很可能是多种调控蛋白复制叉协同作用的综合结果，而抑制所完成的仅是全部过程中的一个必要起始步骤。人们对这一系列的过程仍需进行更深入的研究。另外，作为拓扑异构酶抑制剂，金属配合物有其独特的优势，虽然迄今这方面的研究还很少，但有望会在不久的将来成为一个研究热点。

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