RP-HPLC法测定哈蟆油中胆固醇棕榈酸酯含量

王永生，迟 航，徐 阳，罗 阳，曲晓波*

(1.长春中医药大学，长春130117;2.吉林大学，长春130021)

RP-HPLC法测定哈蟆油中胆固醇棕榈酸酯含量

王永生1，2，迟 航1，徐 阳2，罗 阳1，曲晓波1*

(1.长春中医药大学，长春130117;2.吉林大学，长春130021)

目的 运用RP-HPLC法测定哈蟆油中胆固醇棕榈酸酯的含量。方法 使用Agilent zorbax-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流动相∶甲醇-水(79∶21);柱温:30℃;体积流速:1.5 mL/min;检测波长:210 nm;进样量均为10 μL。结果 哈蟆油中胆固醇棕榈酸酯进样量在0.188 4～0.502 4 μg范围内呈良好的线性关系，平均回收率为100.61%，RSD值为1.01%，且重复性、精密度、稳定性均良好。结论 此方法可以通过RP-HPLC法快速、稳定、精密的测定哈蟆油中胆固醇棕榈酸酯的含量，减少以往利用正相色谱的不便。

哈蟆油;RP-HPLC法;胆固醇棕榈酸酯;含量测定

哈蟆油，又名雪蛤油，哈士蟆油等，始载于明代《本草纲目》，具有补肾益精，养阴润肺的功效，是我国一种名贵的动物药材，有极高的营养保健价值。哈蟆油中有一半以上为蛋白质、氨基酸类，更含有不饱和脂肪酸、激素、磷脂类、核酸类、固醇类、酰胺类、维生素、糖类和微量元素等［1-7］。哈蟆油中胆固醇棕榈酸酯为哈蟆油滋阴壮阳的主要药效成分［8-11］，本文拟利用RP-HPLC法对哈蟆油的主要有效成分胆固醇棕榈酸酯进行含量测定，建立新的哈蟆油质量测定方法。

1 材料

仪器:安捷伦1260型液相色谱仪(美国安捷伦有限公司);AVW20D型电子天平(日本岛津制作所);RE 52-99旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);KQ-400KDE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。试药:胆固醇棕榈酸酯对照品(自制，纯度99%以上);甲醇为色谱纯级，石油醚为分析级，水为娃哈哈纯净水。样品:哈蟆油(Ranae oviductus)，购于2012年12月，经长春中医药大学姜大成教授鉴定为蛙科动物中国林蛙的输卵管干制品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱:Agilent zorbax C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相∶甲醇-水(79∶21);柱温:30℃;体积流速:1.5 mL/min;检测波长为210 nm;进样量均为10 μL。理论塔板数按胆固醇棕榈酸酯计算均不低于2 000。在此条件下，胆固醇棕榈酸酯与其他物质分离度均符合药典规定。

2.2 对照品溶液的配制 精密称取胆固醇棕榈酸酯3.14 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成0.031 4 mg/mL的胆固醇棕榈酸酯标准品溶液。

2.3 供试品溶液的配制 哈蟆油粉碎，过60目筛，精密称定1 g，加100 mL的石油醚超声提取约20 min，过滤，在药渣中加入100 mL石油醚超声提取约30 min，过滤，并用100 mL石油醚洗涤药渣，合并石油醚提取液，蒸干，用色谱甲醇溶解并用定容于10 mL容量瓶中。

2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液6，8，10，12，14，16 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积。以色谱峰面积(Y)对溶液浓度(X)作图，得到胆固醇棕榈酸酯的回归方程为Y=5.737 1X－9.241 9，r=0.999 8(n=6)，表明胆固醇棕榈酸酯进样量在0.188 4～0.502 4 μg范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10 μL，重复进入高效液相色谱仪6次，测得胆固醇棕榈酸酯色谱峰面积的RSD值分别为1.85%和1.48%，结果表明此方法精密度良好。

2.6 稳定性考察 精密吸取哈蟆油样品(批号为20121201)制备的供试品溶液 10 μL，分别在 0，2，4，6，8，10，12，24 h 时，依次进样，测得胆固醇棕榈酸酯色谱峰面积的RSD值为1.75%(n=8)，结果表明供试品溶液中胆固醇棕榈酸酯在24 h内稳定。

2.7 重复性实验 取哈蟆油样品(批号:20121201)6分，每分约1 g，精密称定，按“2.3”项下制备供试品溶液，依法进行含量测定，测得胆固醇棕榈酸酯色谱峰面积，并计算出其含量的RSD值为1.65%，结果表明此方法重复性良好。

2.8 加样回收率实验 取胆固醇棕榈酸酯对照品6分，每分约15 mg，定容至10 mL容量瓶中，吸取1 mL，分别加入6分约0.5 g的哈蟆油样品(批号:20121201)与10 mL容量瓶中。按“2.3”项下制备供试品溶液，并进行含量测定，计算回收率。结果胆固醇棕榈酸酯的平均回收率为100.61%，RSD值为1.01%(n=6)，表明此方法回收率良好。

2.9 样品测定 取不同产地哈蟆油样品，按照制备供试品方法制备，分别精密吸取对照品和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪器中，依法进行含量测定，记录色谱峰面积，并按照外标法计算供试品溶液中胆固醇棕榈酸酯的含量，结果见表1。

表1 不同产地哈蟆油中胆固醇棕榈酸酯的含量

3 小结

3.1 提取方法的考察 通过查阅文献，选择对比回流提取和超声提取方法，发现回流提取样品中胆固醇棕榈酸酯含量较低，并杂质成分有所增加，故选用超声波提取法进行提取。

3.2 流动相的考察 通过选择不同比例的乙腈与水(95∶5～85∶15)、甲醇与水(95∶5～75∶25)作为流动相进行试验，结果表明，甲醇与水(79∶21)可以将胆固醇棕榈酸酯和杂质很好的分离，且保留时间适中，峰形良好。

3.3 检测波长的考察 因哈蟆油中成分较为复杂，不同成分的吸收不同，故在实验过程中以考察多种波长下的主峰与杂质的分离度进行筛选其检测波长，至能准确的计算胆固醇棕榈酸酯的含量。胆固醇棕榈酸酯为低波长吸收，过低波长可能影响基线平衡，故选择210 nm为测定波长。

:

［1］范玉林，崔香顺，姚玉霞，等.哈士蟆油成分研究的进展［J］.吉林农业大学学报，1996，18(3):109-115.

［2］胡鑫，刘成柏，陈晓平，等.林蛙油中主要营养保健成分含量的研究［J］.吉林农业大学学报，2003，25(2):218-220.

［3］王丽兰，杨凤和，王春霖，等.哈蟆油核酸含量分析［J］.中草药，1990，21(12):21-23.

［4］赵文英，侯振荣，孙国忱.哈蟆油的研究进展［J］.沈阳药科大学学报，1996，13(1):68-72.

［5］王永生，姜大成，王恩思.哈蟆油脂溶性化学成分的研究［J］.中成药，2006，28(1):93-94.

［6］林纪娴，廖静华，于中泽.中国林蛙与中华大蟾蜍输卵管几种脂溶性维生素的比较分析［J］.中药材，1991，14(12):11-12.

［7］于洋，姜大成，张炜煜.哈蟆油对免疫力低下小鼠体内脂肪酸含量的影响［J］.长春中医药大学学报，2008，24(2):150-151.

［8］卫功庆，张爱武，苏凤燕，等.哈士蟆油与青蛙油脂肪酸及胆固醇的比较研究［J］.吉林农业大学学报，1999，21(S1):39-41.

［9］王永生，赵晓欧，白雪洁，等.哈蟆油薄层色谱指纹图谱研究［J］.特产研究，2009(3):31-33，36.

［10］曲晓波，张炜煜.正确认识哈蟆油的价值［N］.中国中医药报，2012-11-02(7)，2014-05-27.

［11］王永生，姜大成，孟勤，等.HPLC测定哈蟆油中十六烷酸胆甾醇酯含量研究［J］.中国中药杂志，2005，30(13):990-991.

Determination of cholesterol palmitate in oviductus ranae by RP-HPLC

WANG Yongsheng1，2，CHI Hang1，XU Yang2，LUO Yang1，QU Xiaobo1*
(1.Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China;2.Jilin University，Changchun 130021，China)

Abstract:ObjectiveTo determine the contents of Cholesterol palmitate in Oviductus Ranae by RP-HPLC.MethodsThe chromatographic column:Agilent zorbax-C18(4.6 × 150 mm，5 μm);The mobile phase:methanol-water(79:21);The column temperature:30 ℃;The volumetric flow rate:1.5 mL/min;The UV detector was set at 210 nm;The sample size:10 μL.ResultsCholesterol palmitate showed good liner relation when the content was during 0.188 4 ～0.502 4 μg in the samples，the average recovery was 100.61%，RSD=1.01%，good stability，precision and repeatability;ConclusionThis method can determine the contents of Cholesterol palmitate in Ranae Oviductus，it is fast，accurate and stable and reduce the use of normal phase chromatography inconvenience in the past.

Key words:ranae oviductus;RP-HPLC;cholesterol palmitate;content determination

R284.1

A

2095－6258(2014)04－0604－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.015

国家科技支撑计划项目(2011BAI03B07)。

王永生，博士，教授，博士研究生导师。研究方向:中药有效成分研究。

曲晓波，女，博士，教授，博士研究生导师，电话:0431-86172508，电子信箱:quxiaobo0504@hotmail.com。

(

2014－05－27)