四逆散对慢性应激抑郁模型大鼠行为学及神经递质的影响

李 明，徐向东

(山东中医药大学附属医院，济南250011)

四逆散对慢性应激抑郁模型大鼠行为学及神经递质的影响

李 明，徐向东*

(山东中医药大学附属医院，济南250011)

目的 观察四逆散对抑郁模型大鼠行为学及神经递质(5-HT、NE、DA)含量的影响。方法 采用慢性轻度不可预见性应激制备大鼠抑郁模型，50只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、盐酸文拉法辛(12.5 mg/kg)组、四逆散(10，5 g/kg)组。连续灌胃给药3周，糖水偏爱实验和open-field实验测定动物行为学，利用荧光分光光度法检测下丘脑中的5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA)的含量，探讨四逆散的抗抑郁作用及机制。结果 与正常组相比，模型组大鼠体质量、蔗糖水偏嗜度、open-field实验得分明显偏低，下丘脑中5-HT、NE和DA的含量低于正常组;与模型组相比，四逆散(10，5 g/kg)组大鼠体质量、蔗糖水偏嗜度、openfield实验得分明显增加，下丘脑中神经递质(5-HT、NE和DA)的含量明显偏高。结论 四逆散可明显改善抑郁模型大鼠的抑郁状态，表现出抗抑郁作用，其机制可能与调节下丘脑神经递质含量有关。

四逆散;下丘脑;5-羟色胺;去甲肾上腺素;多巴胺

目前，抑郁症已成为危害人类健康的常见病［1-2］。对于抑郁症的治疗主要以西药，三环类抗抑郁制剂、单胺氧化酶抑制剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂等为主，虽有一定的疗效，但毒副作用较多。近年来，中医药在治疗抑郁症方面显示了巨大的优势，疗效确切，毒副作用少。抑郁症属于中医“情志疾病”中的“郁证”，临证治以疏肝理气、清肝泻火、补益心脾、滋养肝肾等。四逆散主要由柴胡、芍药、枳实、甘草4味药组成，是调和肝脾的代表方剂。本实验通过慢性应激制造大鼠肝郁气滞型抑郁模型，通过大鼠体质量变化、行为学测试和神经递质的变化来探讨四逆散治疗抑郁症的主要作用机制。

1 材料

1.1 动物 清洁级健康SD雄性大鼠50只，体质量180～200 g，由山东中医药大学动物实验中心提供，批号为SCXK(鲁)20090001。

1.2 药物 四逆散由柴胡、枳实、芍药、炙甘草组成，比例为1∶1∶1∶1;购于山东中医药大学附属医院，并经张学顺教授鉴定。取四逆散各180 g(共30剂)，加10倍量的水浸泡1 h后煎煮，沸腾后文火煎40 min，过滤;第2次加8倍量水煎煮，水沸后用文火煎40 min，过滤，合并滤液，常压浓缩至浓度为50%、100%的药液(即含原生药材0.5，1.0 g/mL煎出物)，冷却后密封，4℃保存备用。盐酸文拉法辛胶囊(苏州第四制药厂有限公司，批号20120206)。

1.3 仪器 TC-512型切片机(德国Lezi公司)，DT5-3型低速自动平衡离心机(北京时代北利离心机有限公司)，电子秤(赛多利斯科学仪器有限公司)，DW-86L628型海尔超低温保存箱(－80℃，青岛海尔特种电器有限公司)，BCD-186K型4℃冰箱(海信北京电器有限公司)，RF-530荧光检测器(日本岛津公司)。

2 方法

2.1 分组 对Wistar大鼠进行标记，称重，随机分为正常组、模型组、盐酸文拉法辛组、四逆散低剂量组和四逆散高剂量组。适应性饲养1周后开始造模。

2.2 造模 造模共持续3周，参照文献［3］的方法，以慢性不可预见性的温和刺激，配合孤养，7种不同的刺激按随机方法在21 d内应用:电击足底(36 V电压，每隔5 s电击1次，持续10 s/次，共给予20次)、禁食 24 h、禁水 24 h、夹尾 5 min、4℃冰水游泳10 min、昼夜颠倒、45℃倾斜鼠笼24 h。每天随机给予1种刺激，相同的刺激不能连续出现，使小鼠不能预料刺激的发生，平均每种刺激给予3次。

2.3 体质量测量 每周测量1次。

2.4 灌胃治疗 造模3周后，正常组和模型组灌胃蒸馏水;盐酸文拉法辛组灌胃盐酸文拉法辛溶液(12.5 mg/kg);四逆散低剂量组灌胃5 g/kg的四逆散水煎液;四逆散高剂量组灌胃10 g/kg的四逆散水煎液。灌胃同时，除正常组外，其余各组继续接受刺激。

2.5 行为学测试

2.5.1 蔗糖水偏嗜度 共测量3次，分别在第0，21，42天。断水12 h后在鼠笼上放置质量分数为1%的蔗糖水和蒸馏水2瓶，使其自由饮用，分别称量1 h前后的水瓶质量，计算动物的蔗糖水消耗比例［4］。

2.5.2 open-field敞箱评分 共测量3次，分别在第0，21，42天。Open-field敞箱由木板组成，箱高 40 cm，底面为45 cm×45 cm被分成面积相等的3×3方格的正方形，箱底、内壁均为黑色。实验时将大鼠逐只放入敞箱中心，以5 min内大鼠穿越敞箱底面的方格数为水平运动得分(三爪以上跨入)，穿越1个方格记为1分，两前肢抬起为垂直运动得分(两前肢离地面1 cm以上)，两前肢离地1次记为1分。实验过程中室内安静，光线柔和，室温为(24±1)℃，湿度为(55±10)%。每只动物测定完毕后均对敞箱进行彻底清扫以消除气味对下一只样本的干扰［5］。

2.6 RP-HPLC-荧光法测定海马单胺类递质［6］色谱条件:VP-ODS C18色谱柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动性0.1 mol/L磷酸二氢钾-甲醇90∶10;0.45 μm微孔滤膜过滤，超声脱气;流速1.0 mL/;柱温室温;发射波长330 nm，激发波长290 nm;进样量20 μL。

样品处理:末次给药后，禁食不禁水，24 h后断头处死大鼠，在冰浴上取出海马部分，称重。将称重后的海马倒入玻璃匀浆器中，充分研磨使其匀浆化。将匀浆液加入离心管中，加0.4 mol/L高氯酸溶液适量，涡流2 min，置冷冻离心机(4℃)内以10 000 r/min，离心15 min。将离心后的上清液转入离心管中，再次10 000 r/min，离心10 min，取上清液用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至1 mL，涡流混匀，得样品溶液。按照样品处理项下的方法操作，取样品溶液20 μL注入高效液相色谱仪，根据测得的峰面积按回归方程计算递质的含量。2.7统计学处理数据以均数±标准差(±s)表示，用SPSS 17.0进行方差分析。

3 结果

3.1 各组大鼠体质量的变化 见表1。

表1 给药后各组大鼠体质量变化比较(±s，n=10)g

表1 给药后各组大鼠体质量变化比较(±s，n=10)g

注:与正常组比较，##P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别 剂量/(g/kg) 第28天 第35天 第42天正常组 — 278.00±8.33 299.40 ±6.10 320.75 ±5.03模型组 — 231.45±5.86## 240.90 ±7.42## 251.50 ±4.64##盐酸文拉法辛组 12.5/(mg/kg) 242.95±7.04## 258.45±3.69##△△ 276.80±2.61##△△四逆汤低剂量组 5.0 237.35±9.85## 250.95±4.92##△ 263.80±6.67##△四逆汤高剂量组 10.0 240.85±8.28## 255.20±4.50##△△ 270.15±3.06##△△

3.2 各组大鼠的行为学指标

3.2.1 各组大鼠蔗糖水偏嗜度比较 见表2。

表2 各组大鼠蔗糖水偏嗜度比较(±s，n=10)g

表2 各组大鼠蔗糖水偏嗜度比较(±s，n=10)g

注:与正常组比较，##P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组 别 剂量/(g/kg) 第0天 第21天 第42天正常组 — 93.27 ±1.84 94.63±1.68 95.91 ±1.64模型组 — 93.04 ±3.54 78.51±2.22## 78.75±3.72##盐酸文拉法辛组 12.5/(mg/kg) 92.47 ±3.21 79.84 ±2.43## 88.53 ±2.16##△△四逆汤低剂量组 5.0 93.34 ±1.50 78.74 ±3.16## 81.44 ±2.22##△四逆汤高剂量组 10.0 94.57 ±2.70 79.74 ±3.29 85.32 ±3.61##△△

3.2.2 Open-field实验［7］各组大鼠水平得分、垂直得分比较 见表3。

表3 各组大鼠水平得分及垂直得分比较(±s，n=10)g

表3 各组大鼠水平得分及垂直得分比较(±s，n=10)g

注:与正常组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组 别 剂量/(g/kg)水平积分第0天 第21天 第42天垂直积分第0天 第21天 第42天正常组 — 55.50 ±5.19 54.00 ±5.29 59.70 ±6.34 12.00 ±2.91 13.00 ±1.94 12.60 ±2.21模型组 — 57.20 ±4.05 39.30 ±3.71## 39.60 ±5.76## 10.60 ±1.83 9.40 ±1.43## 8.80 ±1.62##盐酸文拉法辛组 12.5/(mg/kg) 58.10 ±3.63 38.60 ±4.43## 55.00 ±4.06#△△ 11.30 ±2.79 9.10 ±1.79## 11.80 ±1.75△△四逆汤低剂量组 5.0 55.40 ±5.68 39.50 ±2.51## 44.80 ±3.91##△ 11.60 ±2.69 9.60 ±1.40## 10.60 ±1.55##△四逆汤高剂量组 10.0 57.00 ±4.47 39.00 ±3.30## 53.70 ±5.64##△△ 11.80 ±2.04 9.20 ±1.32## 11.10 ±1.91△△

3.3 各组大鼠海马中枢神经递质的含量比较 见表4。

表4 各组大鼠海马中神经递质的含量变化(±s，n=10)ng/g

注:与正常组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01;与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

5-HT DA NE正常组 — 12.16±2.28 4.96±1.12 36.26±6.51组 别 剂量/(g/kg)模型组 — 7.76±3.19## 2.16±0.87## 16.91±4.88##盐酸文拉法辛组 12.5/(mg/kg) 11.27±2.16△△ 4.52±0.36△△ 32.34±5.26△△四逆汤低剂量组 5.0 8.78±1.21#△ 3.01±0.16#△ 25.31±6.21#△四逆汤高剂量组 10.0 10.54±2.12##△ 4.36±1.13△△ 30.40±5.91△△

4 讨论

四逆散是调和肝脾的代表方，具有透邪解郁、疏肝理脾之功效。方中柴胡入肝胆经，疏肝解郁、透邪外出为君药;白芍敛阴养血柔肝，配合柴胡以补养肝血，条达肝气为臣药;佐以枳实理气解郁，与柴胡为伍，一升一降，加强疏畅气机之功，并奏升清降浊之效;使以甘草调和诸药，益脾和中。诸药共奏透邪解郁、疏肝理脾之效，使邪祛郁解，气血调畅，清阳得伸。

研究［8］认为，抑郁症的发生与脑中5-HT、NE和DA含量下降密切相关。抗抑郁药如单胺氧化酶抑制药和三环类抗抑郁药等均可提高5-HT、DA和NE的含量达到抗抑郁的效果。有研究［9］表明，机体中枢内NE能神经元系统与5-HT能神经元系统在调节机体机能活动中常呈现对立统一关系。5-HT对中枢以抑制为主，NE则以兴奋为主，两者含量改变则分别引起情绪激动、急躁易怒与情绪低沉、抑郁寡欢。脑内的DA既是NE的前体，又是一种独立的神经递质，在结构和功能上与NE有密切联系，在中枢神经系统中主要起着调控情绪的作用。因此，大鼠长期接受慢性应激刺激，下丘脑中的神经递质5-HT含量增加，而NE和DA的含量降低。实验结果表明，四逆散可以显著增加大鼠体质量，提高大鼠对蔗糖水的偏嗜度、Open-field实验中的水平得分和垂直得分，说明四逆散有良好的抗抑郁作用。该方能对抗应激所造成的抑郁模型大鼠下丘脑中的5-HT、DA和NE的含量下降，说明模型组大鼠下丘脑中神经递质含量不足，而四逆散可以明显提高神经递质含量。因此，笔者推测四逆散可能是通过增加下丘脑总神经递质的含量来达到抗抑郁作用。

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Effect ofSini Powderon behavior and neurotransmitter of rat with chronic stress-induced depression

LI Ming，XU Xiangdong*
(The Affiliated Hospital to Shandong University of TCM，Jinan 250011，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect ofSini Powderon behavior and neurotransmitter of rat with chronic stressinduced depression.MethodsChronic unpredictable mild stress was used to establish the rat depression model.50 male SD rats were divided randomly into five groups:the normal group，the model group，the venlafaxine(12.5 mg/kg)group and theSini Powder(10，5 g/kg)group.They were orally administered with drugs for three weeks.The sucrose preference test and the open-field test were assayed to detect animal behavior.The contents of 5-hydroxytryptamine(5-HT)、Norepinephrine(NE)and dopamine(DA)by fluorospentrophotometry were tested to clarify the anti-depression effect and mechanism of theSini Powder.ResultsCompared with the normal group，the rats of model group'weight，sugar water consumption，the open-field's score and the content of hypothalamus'neurotransmitter are lower.Compared with the model group，Sini Powderhigh and low dose group could significantly increase the rats'weight，sugar water consumption，the open-field's score and the content of hypothalamus'neurotransmitter.ConclusionSini Powdercan obviously improve depressive state of the rats and conduct the anti-depression.Its mechanism may be related with adjusting the content of neurotransmitter in hypothalamus.

Key words:Sini Powder;hypothalamus;5-HT;norepinephrine;dopamine

R285.5

A

2095－6258(2014)04－0579－04

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.04.006

山东省中医药科技发展计划项目(2011-75)。

李 明(1971－)，男，大学本科，主管药师。研究方向:中药药理研究。

徐向东，硕士，副主任药师，电话:13793188391，电子信箱:zhengsanxiasd@126.com。

(

2014－04－04)